Pancreatin

Pancreatin là một chế phẩm gồm các enzym, chủ yếu là amylase, Lipase và protease, được chiết xuất từ tuyến tụy của lợn [Sus scrofa Linne' var. domesficus Gray (Fam. Suidae)] hoặc của bò (Bos taurus Linne` (Fam.Bovidae).

Mỗi mg pancreatin chứa không ít hơn 25 đơn vị hoạt tính amylase, 2,0 đơn vị hoạt tính lipase và 25 đơn vị hoạt tính protease. Pancreatin ở dạng hoạt tính cao cỏ thể có hoạt lực ghi nhãn gấp 3 lần hoạt tính tối thiểu hoặc có thể được pha loãng bằng cách trộn với Lactose hoặc sucrose chứa tối đa 3,25 % tỉnh bột hoặc với pancreatin hoạt tính thấp.

Một đơn vị hoạt tính Amylase là lượng pancreatin có khả năng phân hủy tinh bột ở tốc độ tương đương với 0, 16 uEq liên kết glycosid được thủy phân trong một phút theo điều kiện quy định của phép thử Định lượng hoạt tính amylase. Một đơn vị hoạt tính lipase là lượng pancreatin có khả năng giải phóng 1,0 uEq acid trong một phút ở pH 9,0 và 37 ⁰C theo điều kiện quy định của phép thử Định lượng hoạt tính lipase.

Một đơn vị hoạt tính Protease là lượng pancreatin có khả năng thủy phân Casein ở tốc độ tương đương với một lượng peptid không bị kết tủa bởi acid tricloroacetic, có độ hấp thụ tương đương với độ hấp thụ của 15 nmol tyrosin ở bước sóng 280 nm, được giải phóng ra trong một phút theo điều kiện quy định của phép thử Định lượng hoạt tính protease. Trong phép thử này đơn vị hoạt tính tương đương với đơn vị USP.

1 Mất khối lượng do làm khô

Không được quá 5,0 % (Phụ lục 9.6).

(60 °C; trong chân không; 4 h).

2 Thử giới hạn nhiễm khuẩn

Không được có Salmonella và Escherichia coli (Phụ lục 13.6).

3 Chất béo

Cân 2,0 g mẫu thử cho vào bình nón 50 ml, thêm 20 mÌ ether (TT). đậy nút, để yên trong 2 h, thỉnh thoảng lắc đều. Lấy dịch ether phía trên bằng cách gạn lớp dịch chảy theo đũa thủy tinh vào giấy lọc thô có đường kính khoảng 7 em (đã được thấm ướt trước bằng ether), thu dịch lọc vào một cốc đã được trừ bì. Lặp lại quá trình chiết với 10 ml ether (TT) theo quy trình trên. Sau đó, lại thêm 10 ml ether (TT) và chuyển toàn bộ ether và phần pancreatin còn lại vào giấy lọc. Sau khi lọc xong, bốc hơi ether ở nhiệt độ thường, làm khô cắn ở nhiệt độ 105 °C trong 2 h.

Yêu cầu:

Chế phẩm pancreatin có hoạt tính bằng hoặc lớn hơn gấp 3 lần hoạt tính tối thiểu: Khối lượng cắn chất béo thu được không được lớn hơn 120 mg (6,0 %). Chế phẩm pancreatin có hoạt tính nhỏ hơn 3 lần hoạt tính tối thiểu: Khối lượng cắn chất béo thu được không được lớn hơn 60 mg (3,0 %).

3.1 Định lượng hoạt tính amylase (Khả năng thủy phân tinh bột)

Dung dịch đệm phosphat pH 6,8: Hòa tan 13,6 g Kali dihydrophosphat (TT) trong nước để được 500 ml dung dịch. Hòa tan 14,2 g dinatri hydrophosphat khan (TT). trong nước để được 500 ml dung dịch. Trộn 51 ml dung dịch kali dihydrophosphat và 49 ml dung dịch dinatri hydrophosphat. Điều chỉnh pH 6,8 nếu cần bằng cách thêm từng giọt dung dịch kali dihydrophosphat hoặc dung dịch dinatri hydrophosphat. Sử dụng trong ngày.

Dung dịch cơ chất: Cân một lượng tinh bột dễ tan tinh khiết tương ứng với 2,0 g chất khan vào cốc, thêm vào 10 mÌ nước, khuấy tạo thành hỗn dịch. Chuyên hỗn dịch này vào 160 ml nước sôi. Tráng cốc bằng 10 ml nước, chuyển vào dung dịch trên, đun sôi, khuấy đều. Làm nguội về nhiệt độ phòng, thêm nước đề được 200 ml. Sử dụng trong ngày.

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng pancreatin chuẩn chứa khoảng 500 đơn vị hoạt tính amylase và chuyển vào trong cối thích hợp. Thêm khoảng 3 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8, nghiền trong khoảng 5 - 10 min. Dùng dung dịch đệm phosphat pH 6,8 chuyên hỗn hợp này vào bình định mức 50 ml, thêm dung dịch đệm phosphat pH 6,8 đến vạch, lắc đều thu được dung dịch chuẩn có chứa 10 đơn vị hoạt tính amylase/ml.

Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng mẫu thử chứa khoảng 1000 đơn vị amylase và chuyển vào trong cối thích hợp. Thêm khoảng 3 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,6; nghiền trong khoảng 5 - 10 min. Dùng dung dịch đệm phosphat pH 6,8 chuyên hỗn hợp này vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch đệm phosphat pH 6,8 đến vạch, lắc đều thu được dung dịch thử có nồng độ tương đương dung dịch chuẩn.

Cách tiến hành

Chuẩn bị 4 bình nón nút mài dung tích 250 ml, đánh dấu S, U, BS, BU. Dùng pipet hút vào mỗi bình 25 ml dung dịch cơ chất, 10 mÌ dung dịch đệm phosphat pH 6,8 và 1 ml dung dịch na clorid (TT) 11,7 g/L, đậy nút bình, trộn đều.

Chuyển các bình vào bể ổn nhiệt đã được duy trì ở 25 +/- 0,1 °C, để ổn định. Thêm 2 ml dung dịch acid hydrocloric 1 N(TT) vào mỗi bình BS, BU; trộn đều và chuyển vào bể ổn nhiệt. Thêm chính xác 1,0 ml dung dịch thứ vào bình U và BU; và 1,0 ml đưng địch chuẩn vào bình S và BS. Trộn đều các bình, chuyển các bình vào bể ổn nhiệt. Sau chính xác 10 min từ thời điểm thêm enzym, thêm 2,0 ml dung dịch acid hydroclorie 1 N (TT) vào bình S và U, trộn đều.

Thêm chính xác 10,0 ml đung địch iod 0,1 N (CĐ) vào môi bình, vừa thêm vừa lắc, ngay lập tức thêm 45 ml dung dịch. Natri hydroxyd 0,1 N (TT). Chuyên các bình vào trong tối ở 15 °C đến 25 °C trong 15 min. Thêm vào mỗi bình 4 ml dung dịch acid sulfuric 2 N (TT), và chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfat 0,1 N (CĐ) đến khi dung dịch mắt màu xanh.

Hoạt lực amylase (số đơn vị) có trong một mg chế phẩm được tính theo công thức:

100(C_S/W_U)( V_BU— V_U) / ( V_BS— V_S)

Trong đó: Cs là hoạt lực amylase trong dung dịch chuẩn (đơn vị hoạt tính amylase/ml);

Wu là lượng cân mẫu thử (mg);

Vu, Vs, Vbu, Vbs là thể tích dung dịch natri thiosulfat 0,1 N (CĐ) (ml) tương ứng dùng để chuẩn độ dung dịch trong các bình U, S, BU, BS.

3.2 Định lượng hoạt tính lipase (Khả năng phân giải chất béo)

Dung dịch acacia: Ly tâm dung dịch acacia (1 trong 10) cho đến khi trong. Chỉ sử dụng dung dịch trong.

Nhũ dịch cơ chất dầu olive: Trộn 165 mÌ dung dịch acacia, 20 ml đâu olive (TT) và 15 g đá bào trong máy đánh nhũ tương. Làm lạnh hỗn hợp trong nước đá đến 5 °C và đánh đồng nhất ở tốc độ cao trong 15 min. Làm mát bằng nước đá đề nhiệt độ không vượt quá 30 °C.

Kiểm tra sự phù hợp của nhũ dịch cơ chất dầu olive như sau: Nhỏ 1 giọt nhñ dịch cơ chất dầu olive lên lam kính, ấn nhẹ nhàng lamen đề dàn mỏng, kiểm tra toàn bộ vi trường ở độ phóng đại cao (vật kính 43x, thị kính 5x), sử dụng thị kính có gắn thước trắc vì đã được hiệu chỉnh. Nhữ dịch cơ chất dầu olive đạt yêu cầu nếu 90 % các hạt có đường kính không lớn hơn 2 µm và không có hạt nào có đường kính lớn hơn 10 µm.

Dung dịch đệm: Hòa tan 60 mg tris(hydroxymethyl) aminomethan (TT) và 234 mg Natri clorid (TT) trong nước vừa đủ 100 ml.

Dung dịch muối mật: Chuẩn bị dung dịch chứa 80,0 mg muối mật (TT) trong 1 ml.

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng pancreatin chuẩn chứa khoảng 400 đơn vị hoạt tính lipase và chuyển vào cối, thêm 3 ml nước lạnh, nghiền 10 min, thêm nước lạnh để thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 8 - 16 đơn vị hoạt tính lipase/ml (dựa trên hoạt lực trên nhãn của chuẩn). Bảo quản ở 4 °C và trộn đều trước khi dùng. Đối với mỗi lần định lượng hút 5 - 10 ml dung dịch lạnh, đề ôn định đến 20 °C trước khi dùng pipet để hút một lượng chính xác.

Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng mẫu thử chứa khoảng 400 đơn vị hoạt tính lipase và chuyển vào cối, thêm 3 mI nước lạnh, nghiền 10 min, thêm nước lạnh đề thu được dung dịch có nồng độ 8 - 16 đơn vị hoạt tính lipase/ml (dựa trên hoạt lực ước tính của mẫu. thử). Bảo quản ở 4 °C và trộn trước khi dùng. Đối với mỗi lần định lượng hút 5 - 10 ml dung dịch lạnh, để ôn định đến 20 °C trước khi dùng pipet để hút một lượng chính xác.

3.2.1 Cách tiến hành

Trộn 10 mI nhũ địch cơ chất dầu olive, 8,0 mÌ dung dịch đệm, 2,0 ml dung dịch muối mật và 9,0 mÌ nước vào cốc thủy tỉnh 2 lớp dung tích 50 ml, khoang bên ngoài của cốc được kết nối với bể ổn nhiệt. Đậy nắp hỗn hợp và trộn liên tục bằng khuấy từ. Duy trì nhiệt độ của hỗn hợp ở 37+/- 0,1 °C, dùng microburet lắp qua nắp rồi nhỏ dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CÐ) vào cốc để điều chỉnh đến pH 9,20 (sử dụng một hệ thống điện cực thủy tỉnh - calomel để đo pH). Thêm 1,0 ml dung dịch thử và sau đó tiếp tục chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ, ) trong 5 min để duy trì pH ở mức 9,0. Xác định thể tích dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ) được thêm vào sau mỗi phút. Tiến hành tương tự mẫu thử thay 1 ml dung dịch thử bằng 1 ml dụng dịch chuẩn.

3.2.2 Tính kết quả

Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa thể tích dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ) theo thời gian. Chỉ sử dụng các điểm nằm trên đường thắng của đồ thị, tính toán lượng acid trung bình giải phóng ra mỗi phút bởi mẫu thử và mẫu chuẩn. Dựa vào độ pha loãng và hàm lượng được phi trên nhãn của pancreatin chuẩn, xác định hoạt tính lipase có trong mẫu thử bằng cách so sánh với mẫu chuẩn.

3.3 Định lượng hoạt tính protease (Khả năng thủy phân casein)

Dung dịch cơ chất casein: Cân 1,25 g casein đã được nghiền mịn vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 5 ml nước, lắc tạo thành hỗn dịch, thêm 10 ml dung dịch natri

hydroxyd 0,1 N (TT), lắc trong 1 min, thêm tiếp 50 ml nước, lắc khoảng 1 h cho hòa tan hoàn toàn. Dung dịch tạo thành phải có pH khoảng 8,0. Nếu cần điều chỉnh tới pH 8,0 bằng cách thêm từng giọt dung dịch natri hydroxyd 1 N (TT) hoặc dung dịch acid hydroclorie 1 N (TT). Chuyển dung dịch thu được vào bình định mức 100 ml, thêm nước vừa đủ thể tích. Sử dụng trong ngày.

Dung dịch đệm: Hòa tan 6,8 g kali dihydrophosphat (TT) và 1,8 g natri hydroxyd (TT) với 950 mÌ nước trong bình định mức 1000 ml; điều chỉnh tới pH 7,5 + /- 0,2 bằng dung dịch natri hydroxyd 0,2 N (CĐ), thêm nước vừa đủ thể tích, trộn đều. Bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh.

Dung dịch acid tricloroacetic: Hòa tan 50 g acid tricloroacefie (TT) trong 1000 ml nước. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Giấy lọc: Xác định tính phù hợp của giấy lọc bằng cách lọc 5 ml dung dịch acid tricloroacetie qua giấy lọc và đo độ hấp thụ của dịch lọc ở 280 nm. Mẫu trắng là dung dịch acid tricloroacetic không lọc. Yêu cầu: Độ hấp thụ của dịch lọc không lớn hơn 0,04. Nếu độ hắp thụ của dịch lọc lớn hơn 0,04 thì rửa lại giấy lọc bằng dung dịch acid tricloroacetic cho đến khi độ hấp thụ của dịch lọc không lớn hơn 0,04.

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng panecreatin chuẩn chứa khoảng 2500 đơn vị hoạt tính protease hòa tan trong 100 ml dung dịch đệm, trộn đều bằng cách lắc không liên tục ở nhiệt độ phòng trong 25 min. Pha loãng với dung dịch đệm để được dung dịch có nồng độ khoảng 2,5 đơn vị hoạt tính protease/ml (dựa vào hoạt lực ghi trên nhãn của chuẩn).

Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng mẫu thử chứa khoảng 2500 đơn vị hoạt tính protease và chuyển vào cối. Thêm 3 ml dung dịch đệm, nghiền trong 5 đến 10 min. Dùng dung dịch đệm để chuyển hỗn hợp trên vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch đệm vừa đủ tới vạch, lắc đều.

Pha loãng bằng dung dịch đệm để thu được dung dịch thử có nồng độ tương đương với nồng độ của dung dịch chuẩn.

3.3.1 Cách tiến hành

Chuẩn bị các ống phản ứng như sau:

Ông chuẩn và Ông thử: Đánh dấu S1,S2,S3,  cho các ống chuẩn và U cho ống thử. Hút lần lượt 2,0 ml; 1,5 ml; 1,0 ml, dung dịch đệm vào các ông S1; S2; và U; S3;. Hút lần lượt 1,0 ml; 1,5ml; 2,0 ml  dung dịch chuẩn vào các ông S1, S2, S3; và 1,5 ml dung dịch thử vào các ống U.

Ống đối chứng của chuẩn và thử: Đánh dấu S1B,S2B; S3B cho các ống đối chứng chuẩn và U; cho ống đối chứng thử. Hút lần lượt 2,0 ml; 1,5 ml; 1,0 ml dung dịch đệm vào các ông  S1B,S2B và UB; S3B. Hút lần lượt 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml dung dịch chuẩn vào các ông  S1B,S2B; S3B và 1,5 mÌ dung dịch thử vào ống UB. Hút 5,0 ml dung dịch acid tricloroacetic vào một trong mỗi ống trên, lắc đều.

Ống màu trắng (đánh đấu B): Gồm 3 ml dung dịch đệm với Š mÌ dung dịch acid tricloroacetic, trộn đều.

3.3.2 Tiến hành phản ứng

Ủ tất cả các ông ở 40 °C trong bể ổn nhiệt, thêm vào mỗi ống một que khuấy bằng thủy tỉnh và cân bằng nhiệt độ. Tại thời điểm t = 0, lần lượt thêm vào mỗi ống 2,0 ml dung dịch cơ chất casein (dung dịch cơ chất casein đã được ủ trong bể ôn nhiệt ở 40 °C), trộn đều. Sau chính xác 60 min kể từ khi thêm dung dịch cơ chất, dừng phản ứng bằng cách thêm 5 ml dung dịch acid tricloroacetic vào các ống S1,S2,S3, và U, trộn đều và đưa các ống ra khỏi bề ôn nhiệt.

Để tắt cả các ống ở nhiệt độ phòng trong 10 min cho kết tủa hết protein, lọc lấy dịch. Đo độ hấp thụ của dịch lọc ở bước sóng 280 nm, mẫu trắng là dịch lọc ống B.

3.3.3 Tính kết quả

Hiệu chỉnh độ hấp thụ của các dịch lọc ống S1,S2,S3, bằng cách trừ đi độ hấp thụ tương ứng của các dịch lọc ống S1B,S2B; S3B. Dựng đường biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa độ hấp thụ và thể tích dung dịch chuẩn trong các ống S1,S2,S3. Trên cơ sở đường tuyến tính này, dựa vào độ hấp thụ (U - UB), hệ số pha loãng của dung dịch thử và hoạt lực của protease trong pancreatin chuẩn tính hoạt lực của protease trong mẫu thử.

4 Bảo quản

Trong đồ đựng kín, để nơi khô mát, tránh ánh sáng.

5 Loại thuốc

Enzym tiêu hóa.