Xác định công hiệu thành phần bạch hầu trong vắc xin hấp phụ chứa giải độc tố bạch hầu (Phụ lục 15.23)

Xác định công hiệu của giải độc tố bạch hầu hoặc thành nhần bạch hầu trong vắc xin phối hợp, hấp phụ được xác định bằng 1 trong 2 phương pháp: Thử thách trên chuột lang hoặc chuẩn độ huyết thanh chuột nhắt trên tế bào Vero.

1 Phương pháp thử thách trên chuột lang

1.1 Miễn dịch cho chuột

Sử dụng ít nhất 3 độ pha loãng bậc 2 (nhưng không quá 5 độ pha) cho cả vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin thử. Mỗi độ pha dùng ít nhất 16 chuột lang khỏe mạnh, 3 đến 5 tuần tuổi, chưa sử dụng cho bất kỳ mục đích nào trước đó. Cân nặng mỗi chuột từ 250 g đến 350 g. Có thể sử dụng chuột khác giới nhưng phải phân chia đều cho các độ pha vắc xin và nhốt riêng lồng. 

Các vắc xin được pha bằng nước muối sinh lý vô khuẩn và lựa chọn các độ pha sao cho ED₅₀ trung bình không nằm ngoài các độ pha loãng của vắc xin. Mỗi chuột trong các nhóm miễn dịch được tiêm dưới da 1 ml huyền dịch của độ pha vắc xin tương ứng. Thời gian miễn dịch là 28 ngày. Chọn ra 3 nhóm chuột đối chứng, mỗi nhóm 4 con đến 6 con, không tiêm gì và nuôi song song với các nhóm chuột miễn dịch bởi vắc xin.

Ví dụ pha vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin mẫu thử như sau:

Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn chứa 180 IU/ống được hoàn nguyên trong 18 ml nước muối sinh lý (NMSL), pha thành ít nhất 3 độ pha loãng bậc 2 để có các độ pha tương ứng với 10 IU/ml; 5 IU/ml và 2,5 IU/ml như sau:

A (1/18) = 1 ống vắc xin mẫu chuẩn + 18 ml NMSL

B (1/36) = 9 ml A + 9 ml NMSL

C (1/72) = 9 ml B + 9 ml NMSL

Vắc xin mẫu thử cùng được pha thành ít nhất 3 độ pha loãng bậc 2 bằng nước muối sinh lý vô khuẩn như sau:

A (1/20) = 1 ml vắc xin mẫu thử + 19 ml NMSL

B(1/40) = 9ml A + 9ml NMSL

C (1/80) = 9 ml B + 9 ml NMSL

1.2 Thử thách

Hộc tố bạch hầu dùng cho thử thách phải có ít nhất 10000 LD₅₀/Lf. Sau 4 tuần, toàn bộ chuột lang đã tiêm miễn dịch được tiêm thử thách dưới da 1 ml độc tố bạch hầu chứa 100 LD₅₀/ml. Pha loãng độc tố bạch hầu để có Dung dịch chứa 1 LD₅₀, dùng tiêm dưới da cho nhóm chuột đối chứng, mỗi con 1 ml. Theo dõi chuột hàng ngày trong 5 ngày, ghi lại số chuột sống và chết trong mỗi độ pha miễn dịch và các nhóm chuột đối chứng.

1.3 Tính kết quả

Căn cử vào số chuột sống sót trong mỗi độ pha vắc xin vào ngày thứ 5 sau khi thử thách, công hiệu vắc xin được xác định bằng phương pháp Probit analysis.

Vắc xin đạt yêu cầu về công hiệu bạch hầu nếu có không ít hơn 30 IU trong một liều đơn vắc xin cho người với điều kiện 95 % khoảng tin cậy của công hiệu tìm được nằm trong giới hạn từ 50 % đến 200 %, hoặc khi giới hạn cận dưới của 95 % khoảng tin cậy của công hiệu ≥ 30 IU trong một liều đơn vắc xin cho người.

Thử nghiệm có giá trị khi: Liều thử thách chứng minh chứa xấp xỉ 50 - 200 LD₅₀/ml. Giá trị ED₅₀ trung bình của vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin thử nằm trong khoảng giữa liều miễn dịch thấp nhất và cao nhất. Thử nghiệm cần đáp ứng được tiêu chuẩn về tính tuyến tính và tính song song giữa liều miễn dịch và sự đáp ứng của chuột giữa vắc xin chuẩn và mẫu thử.

2 Phương pháp chuẩn độ huyết thanh chuột nhắt trên tế bào Vero

2.1 Miễn dịch cho chuột

Mỗi vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin mẫu thử được tiến hành 4 độ pha loãng bậc 2. Các vắc xin được pha loãng bởi nước muối sinh lý vô khuẩn. Lựa chọn các độ pha vắc xin căn cứ vào hàm lượng giải độc tố bạch hầu có trong từng loại vắc xin.

Mỗi độ pha dùng ít nhất 8 chuột nhắt trắng khỏe mạnh, chưa sử dụng cho bất kỳ mục đích nào trước đó. Cân nặng chuột từ 12 g/con đến 14 g/con, 3 đến 4 tuần tuổi, cùng giới (nếu khác giới phải phân đều cho các độ pha khác nhau và nhốt riêng lồng).

Mỗi chuột trong từng nhóm được tiêm dưới da 0,5 ml huyền dịch vắc xin tương ứng với từng độ pha của vắc xin mẫu thử và mẫu chuẩn. Thời gian miễn dịch là 5 tuần.

Vi dụ: Pha vắc xin mẫu chuẩn và thử như sau:

Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn chứa 688 IU được hoàn nguyên trong 8 ml nước muối sinh lý để có hỗn dịch (*) chứa 88 IU/ ml. Tiếp tục pha loãng bậc 2 để có 4 độ pha A - B - C -D như sau:

A (1/2) = 8 ml (*) + 8 ml NMSL

B (1/4) = 8 ml A + 8 ml NMSL

C (1/8) = 8 ml B + 8 ml NMSL

D (1/16) = 8 ml + 8 ml NMSL

Ví dụ vắc xin thử pha như sau:

A (1/5) = 4 ml vắc xin + 16 ml NMSL

B (1/10) = 8 ml A + 8 ml NMSL

C (1/20) = 8 ml B + 8 ml NMSL

D (1/40) = 8 ml C + 8 ml NMSL

2.2 Lấy máu và thu thập huyết thanh chuột miễn dịch

Sau khi tiêm miễn dịch 5 tuần, mỗi chuột được lấy máu riêng rẽ (lấy máu tim bằng bơm tiêm loại 1 ml vô trùng) và tách lấy huyết thanh miễn dịch. Huyết thanh được bất hoạt ở 56 °C trong 30 min. Sau đó có thể ghi các mẫu huyết thanh chuột miễn dịch ở nhiệt độ -20 ºC cho đến khi chuẩn độ huyết thanh trên tế bào.

2.3 Chuẩn độ kháng thể kháng bạch hầu trên tế bào Vero

2.3.1 Chuẩn bị tế bào Vero

Chuẩn bị môi trường M199:

Môi trường M199 bột khô hòa tan trong nước cất 2 lần. Điều chỉnh đến pH 7,0 - 7,2 bằng dung dịch Natri bicarbonat. Môi trường nuôi cấy tế bào có chứa penicilin và Streptomycin và 5 % đến 10 % huyết thanh bào thai bê.

Nuôi tế bào Vero:

Tế bào Vero giữ trong nitrogen lỏng được lấy ra và làm tan băng nhanh dưới vòi nước. Ly tâm loại bỏ phần nước. Cặn được hòa trong môi trường M199 và nuôi trong chai Nhựa 25 cm² ủ ở 37 ºC. Sau 4 đến 6 ngày, khi tế bào mọc kín thành một lớp, dùng dung dịch trypsin 0,25 % tách tế bào và cấy chuyền qua chai nuôi tế bào 75 cm². Tiếp lục ủ ở 37 °C trong 4 ngày đến 6 ngày. Khi tế bào mọc kín thành một lớp, dùng dung dịch trypsin 0,25 % tách tế bào. Pha thành hỗn dịch tế bào có đậm độ là 2,5 x 10⁵ tế bào/ml dùng để chuẩn độ.

2.3.2 Tìm liều độc tố bạch hầu ức chế tế bào Lm/10000

Liều độc tổ Lm/10000 là liều độc tố tối thiểu sau khi trung hòa với 0.0001 IU kháng độc tố bạch hầu còn khả năng ức chế sự phát triển của tế bào Vero. Xác định liều Lm/10000 của độc tố bạch hầu bằng phương pháp sau đây:

Độc tố bạch hầu chuẩn được pha loãng thành nhiều nồng độ khác nhau trong môi trường M199 để có nồng độ khoảng 0,2 Lf/ml.

Pha loãng dộc tố hạch hầu 0,2 Lf/ml trên phiến chuẩn độ từ cột 1 đến 11.

Thêm huyết thanh chuẩn kháng bạch hầu có nông độ 0,002 IU/ml vào các giếng trên.

Sau khi ủ phiến 1 h ở nhiệt độ phòng, thêm vào tất cả các giếng dung dịch tế bào vero có nồng độ 2,5 X 10⁵ tế bào/ml. Lắc nhẹ và dán kín phiến bằng giấy dán phiến.

Ủ ở 37 °C trong 5 ngày đến 6 ngày.

Đọc kết quà và tính liều Lm/10000 của độc tố bạch hầu.

2.3.3 Chuẩn độ kháng thể kháng bạch hầu trên tế bào Vero

Mỗi phiến dùng để chuẩn độ 8 mẫu huyết thanh của 1 độ pha vắc xin.

Cho 50 µl môi trường M199 vào tất cả các giếng của phiến (trừ giếng A₁₁ và A₁₂). Riêng giếng G₁₁, G₁₂, H₁₁, H₁₂ cho 100 µl.

Lấy 8 mẫu huyết thanh chuột đã tiêm miễn dịch của mỗi độ pha vắc xin cho lần lượt vào các giếng từ A₁ đến H₁, mỗi giếng 50 µl. Pha loãng bậc 2 từ dãy số 1 đến dãy số 10. Huyết thanh chuẩn kháng bạch hầu có 10 IU/ml pha thành 0,008 IU/ ml (**).

Cho 50 µl huyết thanh (**) vào các giếng A₁₁, A₁₂ và B₁₁, B₁₂. Từ B₁₁ và B₁₂ pha loãng bậc 2 xuổng C₁₁, C₁₂ và D₁₁, D₁₂; sau khi pha loãng và trộn đều ở các giếng D₁₁, D₁₂ thì bỏ đi 50 µl ở mỗi giếng trong 2 giếng này.

Pha độc tố chuẩn để có liều Lm/10000, cho 50 µl độc tố vào tất cả các giếng trừ giếng G₁₁, G₁₂, H₁₁, H₁₂ (chứng tế bào).

Lắc phiên và ủ 1h ở nhiệt độ phòng. Cho thêm vào các giếng 50 µl hỗn dịch tế bào có đậm độ 2,5 x 10⁵ tế bào/ml. Dán kín phiến bằng màng dán phiến và để ở 37 ºC trong 5 ngày đến 6 ngày. Đọc kết quả.

2.3.4 Cách đọc và tính kết quả

Có thể đọc kết quả bằng cách trực tiếp soi các giếng chuẩn độ dưới kính hiển vi phản pha hoặc dựa vào việc đổi màu để phân biệt giếng “âm tính” và “dương tính”. Sự thay đổi màu từ đỏ sang vàng được coi như không có sự ức chế trao đổi chất do các độc tố đã bị trung hòa bởi các kháng thể kháng độc tố. Hiệu giá kháng thể được tính theo điểm là giếng cuối cùng vẫn còn tế bào mọc (môi trường có màu vàng).

Căn cứ vào số giếng “dương tính”, tính kết quả theo phần mềm Parallel line (phần mềm WIIO program).

Thử nghiệm có giá trị khi: Giếng A₁₁ - D₁₁ và A₁₂ - D₁₂ cho thấy rõ liều Lm/10000 được pha đúng: Sau 6 ngày không xảy ra sự ức chế trao đổi chất ở giếng A₁₁ - A₁₂ và B₁₁ - B₁₂ (màu vàng).

Ngược lại có xảy ra sự ức chế trao đổi chất ở giếng C₁₁ - C₁₂ và D₁₁ - D₁₂ (màu đỏ).

Sự ức chế trao đổi chất sẽ xảy ra ở giếng E₁₁ - E₁₂ và F₁₁ - F₁₂ (màu đỏ) là những giếng chứng độc tố (không có kháng huyết thanh để trung hòa độc tố nên độc tố đã gây hủy hoại tế bào).

Ở các giếng G₁₁ - ₁₂ và H₁₁ - H₁₂ các tế bào phát triến bình thường và môi trường có màu vàng, đó là những giếng chứng tế hào (không có độc tố và kháng huyết thanh bạch hầu). Thử nghiệm phải đạt được các tiêu chuẩn đặt ra trong thử nghiệm Parallel line nghĩa là phải tạo được đường thẳng và đường song song trong mối tương quan giữa liều miễn dịch và đáp ứng.

Trị số Yg cùa vắc xin chuẩn (là số các giếng dương tính trung bình ở mỗi độ pha vắc xin) sẽ phải nằm trong giá trị trung bình tích lũy ± 2SD của tất cả các thí nghiệm tiến hành trước đó.

2.4 Tiêu chuẩn chấp thuận

Vắc xin đạt yêu cầu về công hiệu bạch hầu nếu có không ít hơn 30 IU trong một liều đơn vắc xin cho người với điều kiên 95 % khoảng tin cậy của công hiệu tìm được nằm trong giới hạn từ 50 % đến 200 %, trừ khi giới hạn cận dưới của 95 % khoảng tin cậy của công hiệu ≥ 30 IU trong liều đơn vắc xin cho người.

Nếu kết quả không đạt yêu cầu nhưng thử nghiệm có giá trị (valid test) thì phải nhắc lại thử nghiệm trên mẫu huyết thanh miễn dịch còn lưu và làm thử nghiệm kép. Kết quả sẽ là giá trị trung bình của 2 thử nghiệm nhắc lại. Nếu thử nghiệm nhắc lại đạt yêu cầu thì loạt vắc xin được coi là đạt công hiệu thành phần bạch hầu. Nếu thử nghiệm nhắc lại không đạt yêu cầu, loạt vắc xin bị coi là không đạt công hiệu thành phần bạch hầu và phải hủy bỏ. 

Nếu kết quả không đạt yêu cầu nhưng thử nghiệm không có giá trị (invalid test) thì chỉ cần nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu và số lượng chuột bằng lần 1 (trình tự thử nghiệm lặp lại giống lần 1). Nếu ở lần thử nghiệm nhắc lại vẫn không đạt yêu cầu thì loạt vắc xin bị coi là không đạt yêu cầu về công hiệu thành phần bạch hầu và phải hủy bỏ.