Tobramycin

Tobramycin là 4-O-(3-amino-3-deoxy-a-D-glucopyranosyl)- 2-deoxy-6-0-(2,6-diamino-2,3-6-trideoxy-a-D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamin, được điều chế từ Streptomyces tenebrarius hoặc bằng các phương pháp khác, phải chứa không ít hơn 900 µg C18H37N5O9 trong 1 mg, tính theo chế phẩm khan.

1 Tính chất

Bột trắng hoặc gần như trắng. Dễ tan trong nước, rất khó tan trong Ethanol 96 %.

2 Định tính

A. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4).

Bản mỏng: Silica gel G.

Dung môi triển khai: Methanol - amoniac - cloroform (60:30:25).

Dung dịch thử; Hòa tan 30 mg chê phẩm trong nước vả

pha loãng thành 5 ml với cùng dung môi.

Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 30 mg tobramycin chuẩn trong nước và pha loãng thành 5 ml với cùng dung môi.

Dung dịch đối chiếu (2): Hồn hợp đồng thể tích của dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (1).

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt 3 µl mỗi dung dịch lên bản mỏng. Triển khai sắc ký đến khi dung môì đi được khoảng 3/4 chiều đài bản mỏng. Lấy bản mỏng ra, đê dung môi bay hơi và sấy bân mỏng ở 105 °c trong 15 min. Ngay lập tức phun dung dịch ninhydrin (TT) 1 % trong hỗn hợp dung môi 1-butanol - pyridine (100 : 1). Vết tobramycin có màu hồng, vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng về vị trí so với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1). Dung dịch đối chiếu (2) chỉ cho một vết duy nhất cỏ vị trí tương ứng với vết chính trên trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1).

B. Trong mục Định lượng, pic chính trên sắc ký đo của dung dịch thử phải có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic tobramycin trôn sắc ký đồ của dung dịch chuẩn.

3 pH

Từ 9,0 đến 11,0 (Phụ lục 6.2).

Hòa tan 1,0 g chế phẩm trong 10 ml nước không có carbon dioxyd (TT) để đo.

4 Tạp chất liên quan

Phương pháp sắc ký lớp mòng (Phụ lục 5.3).

Bản mỏng: Silica gel G.

Dung môi triển khai: Dung dịch Natri clorid 29,2 % - ethanol 96% - nước (5 0 :3 0 : 20).

Dung dịch hypoclorit loăng: Pha loãng 20 ml dung dịch natri hypoclorit (TT) thành 100 ml bằng nước.

Thuốc thử tinh bột - Kali iodid: Hòa tan 1,1 g Kali iodid (TT) trong 60 m! nước, đun sôi trong 15 min, thêm từ từ hỗn dịch của 1,5 g tinh bột (77) trong 10 ml mrớc. Thêm 25 ml nước và đun sôi trong 10 min. Đe nguội và pha loãng thành 100 ml bằng nước.

Dung dịch thử: Chuyển 50 mg chế phẩm vào bình định mức 10 ml, thêm 7 ml nước để hòa tan và điều chỉnh đến pH 5,5 ± 0,4 bằng dung dịch acid sulfuric 0,5 M (TT). Thêm nước đến vạch, trộn đều.

Dung dịch đối chiếu: Pha loãng dung dịch thử bằng nước để thu được dung dịch cỏ nồng độ 0,05 mg/ml.

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt 1 pl các dung dịch trên lên bản mỏng. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 3/4 chiều dài bản mỏng. Lấy bàn mỏng ra, để dung môi bay hơi dưới luồng không khỉ nóng và sấy bản mòng ở 110 °C trong 10 min. Phun lên bàn mỏng đang nóng dung dịch hypoclorit loãng. Làm khô bản mỏng bằng luồng không khí lạnh đến khi phần bản mòng đă phun ở dưới vạch chấm chì cho màu xanh lam nhạt khi nhỏ một giọt thuốc thừ tinh bột - kali iod. Tiếp tục phun bản mòng hang thuốc thử tinh bột - kali iodid, cảc vết cỏ màu đò tía hơi xanh xuất hiện ngay. Bất kỳ vết phụ nào trên sắc kỷ đồ thu được từ dung dịch thừ không được có màu đậm hơn màu của vết chính trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch đối chiếu ( 1,0 %).

5 Nước

Không được quá 8,0 % (Phụ lục 10.3).

Dùng 0,3 g chế phẩm.

6 Tro sulfat

Không được quá 0,3 % (Phụ lục 9.9; phương pháp 2).

Dùng 1,0 g chế phẩm.

7 Nội độc tố vi khuẩn

Không được quá 2,00 EU/mg (Phụ lục 13.2).

Nếu chế phẩm dùng để sản xuất thuốc tiêm mà trong quy trình không có giai đoạn tiến hành loại bò nội độc tố vi khuẩn thì phải đáp ứng yêu cầu của phép thử này.

8 Định lượng

Phương pháp sắc ký lòng (Phụ lục 5.3).

Pha động: Hòa tan 2,0 g tris(hydroxymethyl)aminoethan (TT) trong 800 ml nước. Thêm 20 ml dung dịch acid sulfuric 0,5 M (TT) vào dung dịch thu được và pha loãng thành 2000 ml bằng acetonitril (TT). Đe nguội, lọc qua màng lọc 0,2 pm. Điều chỉnh nếu cần.

Thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzene: Pha dung dịch 2,4-dimtrofỉourobenzen (TT) có nồng độ 10 mg/ml trong ethanol 96 % (TT). Dung dịch được dùng trong vòng 5 ngày sau khi pha, bảo quản trong tủ lạnh. Thuốc thử tris(hvdroxymethvỉ)aminomethan: Pha dung dịch chuẩn gốc chứa tris(hydroxymethyl)aminomethane (TT) nồng độ 15 mg/ml trong nước. Dung dịch này dùng được trong vòng 1 tháng, bảo quản trong tù lạnh. Lấy 40 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 200 ml, thêm dimethyl sulfoxid (TT) và trộn đều, thêm dimethylsulfoxid (TT) đến vạnh. Thuốc thừ này được dùng trong vòng 4 h. (Nếu nhúng chìm trong nước đá ờ nhiệt độ dưới 10 °C thì có thể dùng thuốc thử này trong vòng 8 h).

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 55 mg chế phẩm vào bình định mức 50 ml, thêm 1 ml dung dịch acid sulfuric 1M (TT) và thêm nước để hòa tan chế phẩm, sau đó thêm nước đến vạch. Pha loãng 10,0 ml dung dịch thu được thành 50 ml bằng nước.

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 55 mg tobramycin chuân vào bình định mức 50 ml, thêm 1 ml dung dịch acid sulfuric 0,5 M (TT) và thêm nước để hòa tan chế phẩm, sau đó thêm nước đên vạch. Pha loãng 10,0 ml dung dịch thu được thành 50 ml bằng nước.

Tạo dẩn xuất: [Chú ý: Làm nóng các dung dịch ở cùng nhiệt độ, cùng thời gian. Các bình được đặt vào và lấy ra khỏi bể cách thủy (được duy trì nhiệt độ ở 60 °C) đồng thời].

Lần lượt thêm vào 3 bình định mức khác nhau 4,0 ml dung dịch chuẩn; 4,0 ml dung dịch thử và 4,0 ml nước. Thêm vào mỗi bình 10 ml thuốc thử 2,4-dm atrofia ro benzen và 10 ml thuốc thừ tris(hydroxymethyl)aminomethane, lắc đều và đậy nắp bình. Để các bình vào bể cách thủy được duy trì ở 60 °C ± 2 °C trong 50 min ± 5 min. Lấy bình ra, để yên 10 min. Thêm acetonitril (TT) đến gẩn vạch (cách vạch khoảng 2 mĩ), đề nguội về nhiệt độ phòng và thêm acetonitril (TT) đến vạch, lắc đều. Các dung dịch thu được sau khi tạo dẫn xuất tẩn lượt là các dung dịch dẩn xuất chuẩn, dung dịch dẫn xuất thừ và dung dịch mẫu trắng.

Dung dịch phân giải: Chuẩn bị dung dịch mới pha p-naphtholbenzein (TT) có nồng độ 0,24 mg/ml trong acetonitrile (TT). Pha loãng 2 ml dung dịch thu được thành 10 ml bằng dung dịch dẫn xuất chuẩn.

8.1 Điều kiện sắc ký

Cột kích thước (30 cm X 3,9 mm) được nhồi pha tĩnh c.

Detector quang phổ tử ngoại đặt ờ bước sóng 365 nm.

Tốc độ dòng: 1,2 ml/min.

Thể tích tiêm: 20 µl.

8.2 Cách tiên hành

Tiến hành sắc ký với dung dịch mẫu trắng để xác định pic dung môi và pic thuốc thử.

Tiến hành sắc ký với dung dịch phân giải, thời gian lưu tương đối của pic p-naphatholbenzein so với pic tobramycin khoảng 0,6. Độ phân giải giữa pic p-naphatholbenzein và pic tobramycin ít nhất là 4,0.

Tiến hành sắc ký với dung dịch dẫn xuất chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic từ 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn không được lớn hơn 2,0 %.

Tiến hành sắc ký với dung dịch dẫn xuất thử và dung dịch dẫn xuất chuẩn.

Tính hàm lượng tobramycin C18H37N5O9 trong chế phẩm dựa vào diện tích pic đáp ứng thu được từ dung dịch dẫn xuất chuẩn, dung dịch dẫn xuất thử và hàm lượng C18H37N5O9

của tobramycin chuấn.

9 Bảo quản

Nếu chế phẩm vô khuẩn, phải bảo quản trong bao bì kín, vô khuẩn.

10 Loại thuốc

Kháng sinh nhóm aminoglycosid.

11 Chế phẩm

Thuốc tiêm, thuốc nhỏ mắt.