Polymyxin B sulfate

Polymyxin B là hỗn hợp muối sunfat của các polypeptid được tạo ra trong môi trường nuôi cấy của một số chủng Paenibacillus polymyxa, hoặc được tạo ra theo các cách thức khác, thành phần chính là polymyxin B 1.

1 Hàm lượng

Tổng hàm lượng polymyxin B1, B2, B3 và B1-1: Không được dưới 80,0 %, tính theo chế phẩm đã làm khô.

Polymyxin B3: Không được quá 6,0 %, tính theo chế phẩm

đã làm khô.

Polymyxin B1-1; Không được quá 15,0 %, tính theo chế phẩm đã làm khô.

2 Tính chất

Bột màu trắng hay gần như trắng, hút ẩm. Tan trong nước, khó tan trong Ethanol 96 %.

3 Định tính

Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau:

Nhóm I: B, D.

Nhóm II: A, C, D.

A. Phương pháp sắc ký lớp mòng (Phụ lục 5.4).

Bản mỏng: Silicagel G.

Dung môi khai triển: Nước - phenol (25 : 75).

Dung dịch thử: Hòa tan 5 mg chế phẩm trong 1 m! hỗn hợp đồng thể tích của acid hydrocloric (TT) và nước. Đun nóng ờ 135 °c trong một ống nghiệm có nút kín trong 5 h.

Bay hơi đến khô trên nồi cách thủy và tiếp tục đun nóng đến khi acid hydrocloric bay hơi hết. Hòa tan cắn trong 0,5 ml nước.

Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 20 mg leucin chuẩn trong nước và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi.

Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan 20 mg threonin chuẩn trong nước và pha loâng thành 10 ml với cùng dung môi.

Dung dịch đổi chiếu (3): Hòa tan 20 mg phenylalanin chuẩn trong nước và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi.

Dung dịch đối chiếu (4): Hòa tan 20 mg serin chuẩn trong nước và pha loãng thành 10 mỉ với cùng dung môi.

3.1 Cách tiến hành

Tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng.

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 pí mỗi dung dịch trên thành các dải rộng 10 µm, sau đó đặt vào bình sắc ký sao cho bản mỏng không tiếp xúc với dung môi khai triển và bản mòng được để thấm hơi dung môi trong ít nhất 12 h.

Triển khai sắc ký với cùng dung môi đến khi dung môi đi được 12 cm. sấy khô bản mỏng ở 100 °c đến 105 °c, để nguội, sau đó phun lên bản mòng dung dịch ninhydrin (TT) sấy ở 110 °C trong 5 min.

3.2 Yêu cầu

Sắc ký đồ của dung dịch thử cho các vết tương ứng với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đổi chiếu (1), (2) và (3), nhưng không cho vết tương ứng với vết trên sắc ký đồ cùa

dung dịch đổi chiếu (4). Sắc ký đồ của dung dịch thừ cũng cho 1 vệt có giá trị Rf rất thấp (acid 2,4-diaminobutyric).

B. Trong phần Định lượng, các pic của polymyxin B, polymyxin B2, polymyxin B3 and polymyxin B1-1 trên sắc ký đồ của dung dịch thừ phải có thời gian lưu tương tự

với thời gian hru của các pic tương ứng trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1).

C. Hòa tan khoảng 2 mg chế phẩm trong 5 ml nước, thêm 5 ml dung dịch natri hydroxyd 10 % (77). Vừa lăc vừa thêm từng giọt của 0,25 ml dung dịch đông suỉỊat ỉ % (TT). Xuất hiện màu tím đỏ.

D. Chế phẩm phải cho phản ứng (A) của sulfat (Phụ lục 8.1).

4 pH

Từ 5,0 đến 7,0 ( Phụ lục 6.2).

Hòa tan 0,2 g chế phẩm trong nước không có carbon dioxyd (TT) và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi.

4.1 Góc quay cực riêng

Từ -78° đến -90°, tính theo chế phẩm đã làm khô (Phụ lục 6.4).

Hòa tan 0,50 g chế phẩm trong nước và pha loãng tới 25,0 ml với cùng dung môi.

5 Tạp chất liên quan

Phương pháp sắc kỷ lòng (Phụ lục 5.3).

Dung dịch A : Hòa tan 4,46 g natri sulfat khan (TT) trong 900 ml nước, điều chỉnh đến pH 2,3 bằng dung dịch acid phosphoric 2 M(TT) và pha loãng thành 1000 ml với nước.

Pha động: Acetonitril - dung dịch A (20 : 80).

Dung môi pha mẫu: Acetonitril - nước (20 : 80).

Dung dịch thử: Hòa tan 50,0 mg chế phẩm trong dung môi pha mẫu và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi.

Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 50,0 mg polymyxin B sulfat chuẩn trong dung môi pha mẫu và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi.

Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 1,0 ml dung dịch đổi chiếu (1) thành 100,0 ml bằng dung môi pha mẫu.

5.1 Điều kiện sắc ký

Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh basedeactivated end-capped octadecylsily silicagel dùng cho sắc ký (5 pm).

Nhiệt độ cột: 30 °c.

Detector quang phổ từ ngoại đặt ở bước sóng 215 nm.

Tốc độ dòng: 1,0 ml/min.

Thể tích tiêm: 20 Ịil,

5.2 Cách tiên hành

Tiến hành sắc ký với thời gian gấp 1,4 lần thời gian lưu của pic polymyxin B 1.

Thời gian lưu tương đối so với polymyxin B 1 (thời gian lưu băng khoảng 35 min): Polymyxin B2 khoảng 0,5; polymyxin B3 khoảng 0,6; polymyxin B 1-1 khoảng 0,8.

Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (1), độ phân giải giữa hai pic polymyxin B2 và pic polymyxin B3 không được nhỏ hơn 3,0.

5.3 Giới hạn

Với tạp chất bất kỳ không được quá 3,0 %. Tổng tạp không được quá 17,0 %.

Bỏ qua các tạp chất có diện tích pic nhỏ hơn 0,7 lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ thu được của dung dịch đối chiếu (2).

6 Sulfat

Từ 15,5 % đến 17,5 %, tính theo chế phẩm đã làm khô.

Hòa tan 0,250 g chế phẩm trong 100 ml nước và điều chỉnh đến pH 11 bằng amoniac (TT). Thêm 10,0 ml dung dịch bari clorid 0,1 M (CĐ) và khoảng 0,5 mg đò tía phthơỉeỉn

(TT). Chuẩn độ bằng dung dịch Trilon B 0,1 M (CĐ), khi dung dịch bắt đầu chuyển màu thêm 50 ml ethanol 96 % (TT), tiếp tục chuẩn độ tới khi màu xanh tím biến mất. 1 ml dung dịch barí clorid 0,1 M (CĐ) tương ứng với 9,606 mg SO4. ;

7 Mất khối lượng làm khô

Không được quá 6,0 % (Phụ lục 9.6).

(1,000 g; 60 °C; phosphor pentoxyd; áp suất không quá670 Pa; 3 h)

8 Tro sulfat

Không được quá 0,75 % (Phụ lục 9.9, phương pháp 2).

Dùng 1,0 g chế phẩm.

9 Chất gây sốt

Nếu chế phẩm dự định để sản xuất thuốc tiêm mà không có thêm một qui trình thích hợp nào nhằm loại bỏ chất gây sốt, thì phải đáp ứng ycu cầu về chất gây sổt (Phụ lục 13.4).

Với mỗi kilogram thể trọng thể, tiêm 1 ml dung dịch có chứa 1,5 mg chế phẩm trong 1 ml nước cất pha tiêm.

10 Định lượng

Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) như mô tả trong phần Tạp chất liên quan với những thay đổi dưới đây.

Tiến hành sắc ký với dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (1).

Tính hàm lượng phần trăm polymyxin B3, polymyxin B1-1, và tổng các polymyxins Bl, B2, B3 và B1-1 

Trong đó:

CBl là hàm lượng phần trăm của polymyxin B/,

ABi là diện tích pic của polymyxin Bỉ trên sắc ký đồ của dung dịch thử,

w, là khối lượng chế phẩm thử (tính theo chế phẩm đã làm khô) trong dung dịch thừ (mg),

Bgi là diện tích pic của polymyxin B1 trên sắc ký đồ của dung dịch đôi chiêu ( 1),

m 2 là khối lượng polymyxin B sulfat chuẩn trong dung dịch đối chiếu (1) (mg),

DB: là hàm lượng phần trăm polymyxin Bi trong polymyxin 

B sulfat chuẩn.

11 Bảo quản

Trong bao bì kín, tránh ánh sáng. Nếu chế phẩm vô khuẩn, bảo quản trong bao bì kín và vô khuẩn.

12 Loại thuốc

Kháng sinh.

13 Chế phẩm

Mỡ tra mắt polymyxin và Bacitracin.