Hướng dẫn đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học in vivo thuốc generic (Phụ lục 14)

Thuốc phát minh là thuốc được cấp phép lưu hành đầu tiên, trên cở sở đã có đầy đủ các số liệu về chất lượng, an toàn và hiệu quả. Thuốc generic là một thuốc thành phẩm nhằm thay thế một thuốc phát minh được sản xuất không có giấy phép nhượng quyền của công ty phát minh và được đưa ra thị trường sau khi bằng phát minh và các bản quyền đã hết hạn. Theo quy định trong đăng ký thuốc của Việt Nam cũng như của nhiều nước khác, đối với các thuốc generic có tác dụng toàn thân mà bản thân dược chất và dạng bào chế không chứng minh được sinh khả dụng tương tự như thuốc phát minh hoặc thuốc đối chứng (đối với các trường hợp không xác định được thuốc phát minh) thì phải có các số liệu chứng minh thuốc generic có tương đương sinh học so với thuốc phát minh hoặc thuốc đối chứng. Hiện nay, Bộ Y tế ban hành thông tư (được cập nhật định kỳ) quy định danh sách các thuốc generic phải nộp hồ sơ chứng minh tương đương sinh học khi nộp hồ sơ đăng ký sản xuất, lưu hành.

Trong đánh giá Tương Dương Sinh Học (TĐSH) in vivo thuốc generic thì khái niệm sinh khả dụng được định nghĩa là tốc độ và mức độ hấp thu dược chất từ chế phẩm thuốc vào hệ tuần hoàn chung. Các đại lượng được sử dụng để biểu thị tốc độ và mức độ hấp thu dược chất vào hệ tuần hoàn chung được ứng dụng trong nghiên cứu TĐSH bao gồm: C_max (nồng độ đỉnh); T_max (thời gian từ khi bắt đầu dùng thuốc đến khi đạt đốn nồng độ đỉnh) và AUC (diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian). Hai chế phẩm thuốc được coi là tương đương sinh học nếu sinh khả dụng của chúng khác nhau không đáng kể khi dùng cùng mức liều trong cùng điều kiện thử nghiệm.

Hướng dẫn này đưa ra một số nguyên tác cơ bản trong đánh giá tương đương sinh học để thu được kết quả tin cậy.

1 Những yêu cầu cơ bản đối với phương pháp phân tích xác định nồng độ dược chất và/hoặc chất chuyển hóa có tác dụng trong mẫu sinh học

Các phương pháp sắc ký, như sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng các detector khác nhau như quang phổ tử ngoại - khả kiến, huỳnh quang, phổ khối thường được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học để xác định nồng độ thuốc (dược chất và/hoặc chất chuyển hóa - chất cân phân tích) trong các mẫu sinh học (thường là các mẫu máu, huyết tương, huyết thanh hay nước tiểu) của người tình nguyện tham gia nghiên cứu. Những phương pháp này có tính đặc hiệu cao: có khả năng tách và định lượng trên cùng một hệ thống và cùng thời điểm. Trong một số trường hợp, có thể sử dụng phương pháp phân tích sinh hóa và sinh học nếu phương pháp có đủ độ đúng, độ chính xác, độ đặc hiệu để xác định được nồng độ thuốc trong các mẫu sinh học. Do quá trình phân tích mẫu sinh học bị ảnh hưởng bởi nhiều yểu tố như lượng mẫu ít, nồng độ thấp, lẫn nhiều tạp chất là các chất nội sinh (lipid, protein, chất nội sinh, chất chuyển hóa...) và sự khác nhau giữa các cá thê, nên phương pháp phân tích phải được thiết lập và thẩm định để đảm bảo độ tin cậy.

1.1 Tinh đặc hiệu

Phái chứng minh được rằng chất xác định được là dược chất hay chất chuyển hóa có tác dụng. Sự phân tích mẫu không bị ảnh hướng bởi các chất nội sinh và chất chuyển hóa có liên quan. Báo cáo kết quả phải bao gồm cả sắc ký đồ của mẫu trắng (dịch sinh học), mẫu chất chuẩn pha trong dịch sinh học và mẫu thử thu được sau khi dùng thuốc. Trong nghiên cứu tính đặc hiệu, phải thực hiện phương pháp thêm chất chuẩn để loại bỏ sai số do nền mẫu. Khi xác định nồng độ chất phân tích trong mẫu sinh học bằng phương pháp sắc ký lỏng - khối phổ cần phải có các nghiên cứu ảnh hưởng của nền mẫu.

1.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Mối quan hệ giữa đáp ứng với nồng độ của chất phân tích phải được đánh giá bằng phương trình toán học phù hợp. Phương trình này phải được xác định bằng các phương pháp phân tích hồi quy phù hợp (như phương pháp bình phương nhỏ nhất). Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất của đường chuẩn có mối quan hệ tuyến tính giữa đáp ứng (xác định bằng các thiết bị phân tích phù hợp) và nồng độ dược chất có trong mẫu. Trong khoảng này, phép phân tích phải thỏa mãn các yêu cầu về độ đúng và độ chính xác theo qui định.

Đường chuẩn phải có ít nhất 6 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một mẫu dịch sinh học (không bao gồm mẫu điểm 0 - mẫu có nồng độ hoạt chất cần phân tích bằng 0). Đường chuẩn hay khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu cần phân tích. Không xác định nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu thử bằng phương pháp ngoại suy.

1.3 Độ đúng và độ chính xác

Độ đúng và độ chính xác được xác định cùng lúc bằng cách sử dụng tối thiểu 3 nồng độ của mẫu chuẩn kiểm tra. 1 nồng độ gần với giá trị nhỏ nhất của đường chuẩn (LLOQ); 1 nồng độ gần với điểm giới hạn trên của đường chuẩn và 1 nồng độ ở gần điểm giữa. Mỗi nồng độ phải được xác định trên ít nhất 5 mẫu. Độ chính xác có thể được biểu thị bằng hệ số biến thiên (CV) trong ngày và giữa các ngày, được xác định trên mẫu chuẩn kiểm tra. Nói chung, CV không nên vượt quá 15 %, riêng điểm gần giới hạn định lượng dưới cho phép không vượt quá 20 %.

Độ đúng được biếu thị là khả năng tiến tới gần nồng độ thực nhất của chất phân tích trong mẫu sinh học được xác định bằng phương pháp đặc biệt. Điều đó có thể được biểu thị bằng khả năng tìm lại tương đối, và phải nằm trong khoảng 85 % đến 115 %, nhưng có thể chấp nhận 80 % đến 120 % đối với điểm gần giới hạn định lượng dưới.

1.4 Giới hạn định lượng dưới

Giới hạn định lượng là nồng độ thấp nhất của đường chuẩn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác cho phép. Giới hạn định lượng dưới ít nhất phải thỏa mãn khả năng phân tích nồng độ của mẫu thử lấy ở thời điểm bằng 3 đến 5 lần thời gian bán thải hoặc bằng 1/20 đến 1/10 giá trị C_max của chất phân tích.

1.5 Độ ổn định của mẫu thử

Độ ổn định của mẫu sinh học có chứa chất phân tích cần được khảo sát khi bảo quản ở nhiệt độ phòng, đông lạnh trong khoảng thời gian khác nhau để xác định điều kiện bảo quản và thời gian bảo quản mẫu sau khi lấy.

1.6 Tỷ lệ thu hồi

Khả năng tìm lại sau khi chiết được đánh giá với ít nhất 3 nồng độ: Cao, trung bình và thấp của đường chuẩn. Giới hạn của chỉ tiêu này có thể tham khảo những tài liệu liên quan.

1.7 Mẫu chuẩn kiểm tra (QC)

Mẫu chuẩn kiểm tra được dùng để so sánh khi định lượng là những mẫu tự tạo biết trước nồng độ, chuẩn bị bằng cách pha chất chuẩn của chất cần phân tích trong mẫu sinh học trắng.

1.8 Phân tích mẫu thử

Định lượng các mẫu thử bằng phương pháp phân tích đã được thẩm định. Mỗi mẫu thử có thể phân tích một lần hoặc lặp lại nếu cần. Toàn bộ các mẫu thử của mỗi người tình nguyện phải được phân tích trong cùng một điều kiện. Một lô mẫu phân tích (các mẫu phân tích trong cùng một điều kiện - trong thời gian một buổi hoặc một ngày) bao gồm toàn bộ các mẫu thử của một hoặc một số người tình nguyện; các mẫu của đường chuẩn/ khoảng tuyến tính và các mẫu QC - với tối thiểu 3 mức nồng độ tương ứng với khoảng nồng độ thấp, trung bình và cao của đường chuẩn/khoảng tuyến tính và tương ứng với mỗi mức nồng độ phải có tối thiểu hai mẫu. Số lượng các mẫu QC của một lô phân tích không được ít hơn 5 % tổng số mẫu thử và cũng không được ít hơn 6 mẫu. Nồng độ chất cần phân tích trong mỗi mẫu thử và các mẫu QC được xác định dựa trên kết quả phân tích các mẫu của đường chuẩn trong lô phân tích. Chỉ chấp nhận kết quả của một lô mẫu phân tích khi: Các mẫu đường chuẩn/khoảng tuyến tính đạt yêu cầu về độ đúng, chính xác và độ lệch giữa kết quả xác định nồng độ chất cần phân tích trong các mẫu QC phải sai khác không quá ± 15 % so với giá trị nồng độ lý thuyết tương ứng. Tiêu chuẩn chấp nhận kết quả lô phân tích được qui định bởi các hướng dẫn cụ thể của Cơ quan quản lý.

2 Qui định chung đối với một nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học

2.1 Lựa chọn đốii tượng tham gia nghiên cứu

Tiêu chuẩn: Đối tượng tham gia nghiên cứu phải tự nguyện tham gia vào nghiện cứu và được lựa chọn theo những tiêu chuẩn phù hợp nhất định. Trong nghiên cứu tương đương sinh học, đa số trường hợp thường chọn đối tượng tham gia nghiên cứu là nam giới khỏe mạnh. Một số trường hợp cần thiết chỉ sử đụng đối tượng là phụ nữ, khi đó cần giải thích rõ. Với thuốc dùng cho trẻ em, vẫn nên chọn người lớn để thử nghiệm. Các tiêu chuẩn cụ thể của đổi tượng tham gia nghiên cứu như sau:

a. Giới tính: Nam hoặc nữ.

b. Tuổi: Thông thường từ 18 tuổi đến 55 tuổi. Trong cùng một nhóm nghiên cứu, giữa các cá thể, khác nhau không quá 10 tuổi.

c. Cân nặng, chiều cao cơ thể: Chỉ số khối lượng cơ thể (Body mass index - BMI) được tính bằng thương số giữa cân nặng cơ thể (đơn vị tính kg) và bình phương chiều cao cơ thể (đơn vị tính m²) của đối tượng tham gia nghiên cứu và phải nằm trong giới hạn trung bình từ 18,0 đến 25,0 (có thể mở rộrtg đến 30 trong một số trường hợp và do cơ quan quản lý qui định). Cân nặng cơ thể của các cá thể trong cùng nhóm nghiên cứu nên gần giống nhau.

d. Người tình nguyện phải có đủ năng lực hành vi dân sự, khỏe mạnh, không có tiền sử về bệnh tim mạch, bệnh gan, bệnh Đường tiêu hóa, bệnh chuyển hóa không bình thường hoặc bệnh về hệ thần kinh.

c. Không có tiền sử về dị ứng và hạ huyết áp tư thế.

f. Không dùng các đối tượng nghiện ma túy, nghiện rượu, nghiện thuốc lá.

g. Trong quá trình thử nghiệm không được sử dụng thuốc lá, rượu và những thức uống khác có chứa Cafein.

h. Không dùng thuốc có chứa dược chất cùng với thuốc nghiên cứu trong vòng 2 tuần trước và trong quá trình thử nghiệm.

i. Chấp thuận tự nguyện ký vào bản cam kết tự nguyện tham gia nghiên cứu.

Đối tượng tham gia nghiên cứu phải được kiểm tra sức khoẻ bao gồm các chỉ tiêu: khám lâm sàng tổng quát, huyết áp, nhịp tim, chức năng gan, thận, phổi và công thức máu. Các kết quả xét nghiệm phải trong giới hạn bình thường. Khi thử những thuốc đặc biệt, có thể phải kiểm tra thêm một số chỉ tiêu khác, ví dụ như đường huyết khi thử nghiệm những thuốc có ảnh hưởng đến đường huyết hay điện tim đối với các thuốc ảnh hưởng đến hoạt động của tim... Nếu đối tượng là phụ nữ thì phải tiến hành làm các xét nghiệm và đảm bảo không mang thai trong quá trình tham gia nghiên cứu.

Số lượng: số lượng người tình nguyện phải đủ theo các yêu cầu, quy định liên quan của Cơ quan quản lý và được tính theo nguyên tắc dùng với số lượng nhỏ nhất có thể được để đảm bảo yếu tố đạo đức trong các nghiên cứu y sinh học nhưng vẫn đảm bảo yêu cầu, mức độ tin cậy thống kê của phép thử. Trong nghiên cứu tương đương sinh học, số lượng người tình nguyện tham gia nghiên cứu được tính trên các dữ liệu: mức độ tin cậy thống kê của phép thử (thường α = 0,1); khoảng giới hạn tương đương sinh học yêu cầu (thường là 80 % - 125 %); mức độ dao động các thông số dược động học trên đối tượng tham gia nghiên cứu và tỷ lệ trung bình thông số dược động học giữa thuốc thử và thuốc đối chứng. Với mỗi nghiên cứu tương đương sính học, cần xác định cụ thể và nêu rõ số lượng người tình nguyện trong đề cương nghiên cứu tương đương sinh học trình Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học phê duyệt theo quy định, số lượng người tình nguyện tham gia nghiên cứu có thể thay đổi tùy từng thuốc, từng nghiên cứu và các quy định liên quan nhưng không được ít hơn 12 người.

2.2 Thuốc nghiên cứu

Thuốc đối chứng: Thuốc (chế phẩm) đối chứng dùng trong nghiên cứu tương đương sinh học phải là sản phẩm đã được cấp phép sản xuất, lưu hành dựa trên các số liệu an toàn, hiệu quả điều trị của sản phẩm và được lựa chọn theo các nguyên tắc với thứ tự ưu tiên lần lượt sau:

- Thuốc phát minh đang lưu hành tại Việt Nam;

- Thuộc danh mục thuốc đối chứng của tổ chức Y tế thế giới;

- Thuốc phát minh đang được lưu hành tại một trong các nước thành viên của Hội nghị hòa hợp quốc tế và các nước liên kết (gồm các nước thuộc EU, Mỹ, Nhật Bản, Canada, Australia, Thụy Sỹ);

- Trong trưòng hợp không xác định được thuốc phát minh, lựa chọn thuốc đối chứng là thuốc đã được cấp phép và đang được lưu hành tại một trong các nước thành viên của Hội nghị hòa hợp quốc tế và các nước liên kết hoặc thuốc đã được đánh giá chất lượng bởi Tổ chức Y tế Thế giới.

Quy định cụ thể thuốc đối chứng dùng trong một nghiên cứu tương đương sinh học do Bộ Y tế ban hành. Thuốc đối chứng được lựa chọn phải đạt tiêu chuẩn chất lượng và phải có nguồn gốc, xuất xứ rõ ràng mới được sử dụng trong nghiên cứu tương đương sinh học. Trong nghiên cứu tương đương sinh học nên lựa chọn thuốc đối chứng có dạng bào chế phù hợp với dạng bào chế của thuốc thử.

Thuốc thử: Thuốc (chế phẩm) thử trong nghiên cứu tương đương sinh học phải được nghiên cứu, sản xuất theo tiêu chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc (GMP) và các quy định liên quan của Cơ quan quản lý với cỡ lô phù hợp. Chỉ được sử dụng lô thuốc thử được sản xuất với cỡ lô đủ lớn, có đầy đủ hồ sơ chế biến và đạt các yêu cầu chất lượng theo tiêu chuẩn đồng thời có hàm lượng dược chất so với hàm lượng ghi trên nhãn sai khác không quá 5 % so với lô thuốc đối chứng trong nghiên cứu tương đương sinh học.

3 Thiết kế và phê duyệt đề cương nghiên cứu

Theo quy định, tất cả các nghiên cứu tương đương sinh học đều phải xây dựng đề cương nghiên cứu. Đề cương nghiên cứu trình bày rõ mô hình/thiết kế nghiên cứu; phương pháp, nội dung nghiên cứu; phương pháp thống kê/đánh giá kết quả nghiên cứu... Đề cương nghiên cứu đều phải được Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học phê duyệt chấp thuận trước khi tiến hành triển khai nghiên cứu. Lựa chọn mô hình nghiên cứu: Kiểu nghiên cứu phổ biến nhất trong nghiên cứu tương đương sinh học, so sánh sinh khả dụng giữa một thuốc thử và một thuốc đối chứng là nghiên cứu đơn liều, chéo 2 x 2 (2 thuốc, 2 giai đoạn, 2 trình tự thử thuốc). Để hạn chế ảnh hường của sự khác biệt giữa các cá thể và giai đoạn thử nghiệm, các đối tượng nghiên cứu được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm. Một nhóm sẽ dược sử dụng thuốc thử trước và thuốc chứng sau; ngược lại, nhóm kia sử dụng thuốc chứng trước và thuốc thử sau. Giữa 2 giai đoạn thử, cần có một khoảng thời gian để đảm bảo cho thuốc của lần thử trước loại hết ra khỏi cơ thể (thường từ 1 đến 2 tuần, gấp khoảng 5 - 7 lần thời gian bán thải t_1/2 của thuốc). Đối với các thuốc có thời gian bán thải kéo dài, có thể áp dụng thiết kế nghiên cứu song song. Trong nghiên cứu song song, đối tượng tham gia thử nghiệm được chia thành 2 nhóm, một nhóm uống thuốc thử và nhóm còn lại uống thuốc đối chứng. Ngoài mô hình nghiên cứu kể trên, trong một số trường hợp có thể áp dụng các mô hình nghiên cứu khác như: Nghiên cứu đa liều (xác định các thông số dược động học của thuốc ở trạng thái ổn định - sau khi dùng thuốc từ 5 đến 7 liều); nghiên cứu lặp lại (sử dụng thuốc thử và/hoặc thuốc đối chứng lặp lại). Nghiên cứu đa liều có thể được áp dụng trong nghiên cứu tương đương sinh học khi:

a. Mức độ hấp thu dược chất từ dạng thuốc tương tự nhau, nhưng khác nhau về tốc độ hấp thu.

b. Sinh khả dụng giữa các cá thể khác nhau nhiều.

c. Sau khi uống liều đơn, nồng độ cùa thuốc dưới dạng tiền chất của thuốc hoặc chất chuyển hóa thấp, không thể xác định được bởi phương pháp phân tích thích hợp.

d. Thuốc giải phóng có kiểm soát, tác dụng kéo dài.

Đối với các nghiên cứu so sánh sinh khả dụng/tương đương sinh học của 2 thuốc thử so với 1 thuốc đổi chứng (trường hợp thuốc thử có nhiều hàm lượng) hoặc nghiên cứu ảnh hưởng của thức ăn/đồ uống tới sinh khả dụng của thuốc thử dạng rắn dùng đường uống đồng thời đánh giá tương đương sinh học của thuốc thử so với thuốc đối chứng, người ta thường sử dụng thiết kế nghiên cứu chéo 3 x 3 (3 thuốc, 3 giai đoạn, 3 hoặc 6 trình tự/phác đồ sử dụng thuốc - tùy theo mô hình nghiên cứu). Tương tự như thiết kế nghiên cứu chéo 2 x 2, giữa mỗi giai đoạn cần có thời gian nghỉ để đảm bảo cho thuốc sử dụng ở giai đoạn trước được thải trừ hết khỏi cơ thể. Thời gian nghỉ (thời gian thải trừ thuốc) giữa mỗi giai đoạn thường gấp khoảng 5 - 7 lần thời gian bán thải của thuốc. Tất cả các nghiên cứu tương đương sinh học có thiết kế nghiên cứu khác với mô hình nghiên cứu phổ biến đều phải nêu rõ lý do giải thích cho thiết kế nghiên cứu và thiết kế nghiên cứu phải được trình bày rõ ràng, chi tiết trong đề cương nghiên cứu trình Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học phê duyệt.

Xác định liều thử: Liều thử trong nghiên cứu tương đương sinh học phải giống với liều dùng trong lâm sàng và nên sử dụng mức liều thấp nhất có thể được mà vẫn xác định được chính xác các thông số dược động học trên đối tượng tham gia nghiên cứu khi sử dụng mức liều đó. Trong nghiên cứu tương đương sinh học tốt nhất là liều thử của thuốc thử phải giống với liều thử của thuốc chứng. Trong trường hợp phải sử dụng liều khác nhau, cần nêu rõ lý do và phải hiệu chỉnh các giá trị dược động học thu được một cách phù hợp theo tỷ lệ mức liều dùng. Thời điểm lấy mẫu: Sau khi sử dụng thuốc, tiến hành lấy các mẫu sinh học (thường là mẫu máu) của mỗi người tình nguyện tại những thời điểm xác định để xác định nồng độ thuốc/dược chất có trong các mẫu. Tiến hành xác định các thông số dược động học dựa trên kết quả xác định nồng độ thuốc/dược chất có trong các mẫu. Do vậy, thiết kế thời điểm lấy mẫu trong nghiên cứu tương đương sinh học rất quan trọng để thu được kết quả nghiên cứu tin cậy. Một đường cong nồng độ thuốc trong máu người tình nguyện theo thời gian hoàn thiện phải bao gồm cả các pha: Hấp thu, phân bố và thải trừ của thuốc.

(1) Nghiên cứa đơn liều, cần phải lấy một điểm trước khi dùng thuốc (mẫu trắng, thời điểm 0) và ít nhất 11 điểm khác sau khi sử dụng thuốc bao gồm nên có ít nhất 3-4 điểm lấy mẫu trước khi đạt tới đỉnh của đường cong nồng độ - thời gian (pha hấp thu), khoảng 3 điểm lấy mẫu xung quanh giá trị đỉnh và không ít hơn 4-6 điểm sau giá trị đỉnh (pha thải trừ). Tổng số điểm lấy mẫu của đường cong nồng độ - thời gian không ít hơn 12. Thời gian lấy mẫu nên kéo dài tới khoảng 3 đến 5 lần thời gian bán thải của dược chất hoặc khi nồng độ dược chất trong mẫu máu bằng khoảng 1/10 đến 1/20 giá trị nồng độ đỉnh. Đối với các thuốc có thời gian bán thải quá dài, có thể kết thúc lấy mẫu ở thời điểm sau khi uống thuốc 72 h.

(2) Nghiên cứu đa liều: Sau khi người tình nguyện đã sử dụng được một số liều trong tổng số liều cần phải sử dụng trong nghiên cứu (thường là từ liều thứ 3 - 5 trong tổng số 5 - 7 liều dùng), trong một khoảng thời gian bằng 7 lần thời gian bán thải của thuốc cần phải lấy 3 mẫu tại 3 thời điểm (dự đoán có nồng độ cực tiểu) liên tiếp, xác định nồng độ thuốc có trong mỗi mẫu để đảm bảo rằng nồng độ thuốc trong máu người tình nguyện đã đạt đến trạng thái ổn định. Nên lấy mẫu máu vào cùng một thời điểm (thường là buổi sáng) của những ngày khác nhau (phù hợp nhất là lấy mẫu ngay trước khi sử dụng thuốc liều kế tiếp) để có thể so sánh được và hạn chế những ảnh hưởng của thời gian tới dược động học. Sau khi nồng độ thuốc đạt đến trạng thái ổn định, tiến hành cho người tình nguyện sử dụng liều cuối trong tổng số liều dùng của một giai đoạn nghiên cứu và tiến hành lấy các mẫu máu của người tình nguyện trong khoảng thời gian dùng liều cuối theo các thời điểm xác định. Đường cong nồng độ thuốc trong máu theo thời gian của người tình nguyện ở trạng thái ổn định (AUC^ss_0-τ) tương tự như đường cong nồng độ - thời gian khi sử dụng đơn liều (AUC_0-t) bao gồm các thời điểm ở pha hấp thu, các điểm xung quanh giá trị đỉnh của đường cong và các thời điểm ở pha thải trừ. Khoảng thời gian từ điểm 0 (sử dụng liều cuối) đến điểm lấy mẫu cuối cùng trong suốt khoảng liều ở trạng thái ổn định bằng τ chính là khoảng thời gian giữa các lần dùng thuốc.

Các mẫu máu (huyết tương, huyết thanh hay máu toàn phần) phải bảo quản đông lạnh ngay sau khi lấy để chờ phân tích. Khi không thể xác định được nồng độ thuốc trong huyết tương, có thể thực hiện trên một mẫu sinh học khác như nước tiểu, nhưng chất xác định được và phương pháp phân tích phải phù hợp đảm bảo kết quả xác định nồng độ thuốc trong các mẫu đúng, chính xác và tin cậy được.

3.1 Tiến hành nghiên cứu

Nghiên cứu đơn liều: Người tình nguyện nhịn ăn qua đêm (ít nhất là 10 h trước khi uống thuốc). Sáng hôm sau, mỗi người sẽ được cho uống một liều thuốc thử hoặc thuốc đối chứng với 240 ml nước ấm. Người tình nguyện không dược uống nước trong vòng 1 h trước và sau khi uống thuốc, trừ lượng nước sử dụng khi uống thuốc. Đối với các nghiên cứu ảnh hưởng của thức ăn tới sinh khả dụng của thuốc hoặc nghiên cứu tương đương sinh học ở tình trạng no, sau khi nhịn ăn qua đêm, người tình nguyện ăn một bữa ăn tiêu chuẩn và uống thuốc với 240 ml nước ấm sau khi ăn 30 min. Bữa ăn tiêu chuẩn trước khi uống thuốc của người tình nguyện thường là bữa ăn giàu năng lượng; nhiều chất béo, tuân thủ theo đúng các quy định liên quan và phải được quy định cụ thể trong đề cương nghiên cứu. Nếu không có yêu cầu gì đặc biệt, người tình nguyện dùng bữa ăn tiêu chuẩn 4 h sau khi uống thuốc. Khẩu phần ăn được qui định giống nhau cho tất cả người tình nguyện và cho các giai đoạn của mỗi nghiên cứu. Tiến hành lấy mẫu máu tĩnh mạch theo thời điểm lấy mẫu đã thiết kế.

Nghiên cứu đa liều: Với các nghiên cứu có nhịp dùng thuốc là 24h (dùng thuốc 1 lần/ngày), nên uống thuốc vào mỗi buổi sáng sau khi đã nhịn ăn ít nhất 10 h, sau đó không ăn gì trong vòng 2 h đến 4 h sau khi uống thuốc. Với các nghiên cứu có chế độ dùng thuốc 2 lần/ngày, liều thuốc đầu tiên nên cho người tình nguyện uống vào buổi sáng sau khi đã nhịn đói ít nhất 10 h, sau đó không ăn gì trong vòng 2 h đến 4 h; liều thứ 2 được uống trước hoặc sau bữa ăn 2 h và tiếp tục nhịn ăn trong vòng 2 h sau khi uống thuốc. Mỗi liều được uống với 240 ml nước ấm. Nói chung, người tình nguyện có thể uống nước sau khi uống thuốc 1 h đến 2 h. Khi thuốc đối chứng là chế phẩm qui ước, nên thử theo mức liều và cách dùng thông thường đã sử dụng trên lâm sàng, nhưng nên chọn mức liều tương đương với liều của thuốc thử dạng giải phóng có kiểm soát hoặc kéo dài.

Theo qui định, các mẫu sinh học (máu, huyết tương, huyết thanh) sau khi lấy sẽ được bảo quản đông lạnh ngay để chờ phân tích. Sau khi uống thuốc, người tình nguyện nên tránh các vận động phải gắng sức. Quá trình lấy các mẫu máu của người tình nguyện phải được thực hiện tại cơ sở y tế có đủ nhân viên y tế (bác sỹ, điều dưỡng); đủ điều kiện chăm sóc sức khỏe và xử lý các biến cố bất lợi, các tai biến y tế nếu xảy ra. Các biến cố bất lợi, các tác dụng phụ xảy ra cấn phải xử trí và điều trị kịp thời. Trường hợp xảy ra biến cố bất lợi nghiêm trọng, cần phải ngừng ngay nghiên cứu và báo cáo các bên liên quan theo đúng quy định.

3.2 Phân tích dược động học

Lập các bảng và hình để biểu thị các dữ liệu nồng độ thuốc trong huyết tương vào những thời điểm lấy mẫu khác nhau của từng cá thể, giá trị trung bình và độ lệch chuẩn. Sau đó tính các thông số dược động học tương đối của mỗi cá thể, giá trị trung bình và độ lệch chuẩn cho mỗi thông số.

Nghiên cứu đơn liều: Những thông số dược động học chính cần phải xác định trong nghiên cứu tương đương sinh học với thiết kế nghiên cứu đơn liều bao gồm: Nồng độ đỉnh trong máu (C_max), Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian (AUC), thời gian bán thải của thuốc (t_1/2) và thời điểm đạt tới nồng độ đỉnh trong máu (T_max), Giá trị C_max và T_max biểu thị bằng số liệu thu được trực liếp từ thí nghiệm và không phải tính toán. Giá trị AUC_0-tn (diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ thời điểm 0 đến thời điểm t) được tính theo phương pháp hình thang, với tn là thời điểm lấy mẫu cuối cùng có thể định lượng được. Giá trị AUC_0-∞ (diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ thời điểm 0 đến vô cùng) được tính toán theo công thức:

Trong đó: C_tn là nồng độ cùa thuốc tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng có thể xác định được bằng phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học được sử dụng trong nghiên cứu; λz là hằng số tốc độ thải trừ.

Giá trị t_1/2 có thể được tính bằng công thức:

Trong đó:  λz hằng số tốc độ thải trừ được tính từ độ dốc của đoạn tuyến tính trên đường biểu diễn logarit nồng độ - thời gian.

Thông thường, một nghiên cứu tương đương sinh học có thời điểm lấy mẫu phù hợp thì tỷ số:

Nghiên cứu đa liều: Sau khi uống đa liều (thông thường từ 5 - 7 liều) với khoảng cách thời gian giữa các liều dùng như nhau, thì thuốc có thể đạt tới trạng thái ổn định. Tiến hành lấy mẫu máu sau khi đạt đến trạng thái liều ổn định, phân tích xác định nồng độ thuốc trong các mẫu máu và tính giá trị các thông số dược động học cơ bản của thuốc trạng thái ổn định như nồng C_max, T_max, AUC^ss_0-t hay giá trị nồng độ trung bình ở trạng thái cân bằng (C_av), khoảng dao động nồng độ thuốc trong máu (DF). Các giá trị C^ss_max, T^ss_max; AUC^ss_0-t ở trạng thái cân bằng được tính toán bằng phương pháp tương tự tương ứng như thử nghiệm đơn liều. Nồng độ thuốc trung bình ở trạng thái cân bằng (C_av) có thể được tính như sau:

Trong đó: AUC^ss_0-t là diện tích dưới đường cong nồng độ thuốc - thời gian từ thời điểm 0 đến thời điếm τ trong suốt khoảng liều ở trạng thái ổn dịnh và τ là khoảng thời gian giữa các lần dùng thuốc. Khoảng dao động của nồng độ thuốc trong máu có thể được tính theo biểu thức:

Trong đó: C^ss_max là nồng độ đỉnh, thu được từ các số liệu thực, sau khi dùng liều cuối cùng ở trạng thái ổn định và C_min là nồng độ cực tiểu ở thời điểm cuối trong khoảng thời gian dùng liều cuối cùng ở trạng thái cân bằng. Nếu thuốc đối chứng cùng là thuốc giải phóng chậm hay thuốc tác dụng kéo dài, DF/τ của thuốc thử phải không lớn hơn 143 % giá trị của thuốc đối chứng.

Ngoài các thông số dược động học cơ bản trong nghiên cứu tương đương sinh học kể trên, tùy theo mục đích cũng như các mô hình nghiên cứu cụ thể còn có thể xác định thêm các thông số dược động học khác như giả trị t_1/2 hấp thu; thời gian lưu trú trung bình (mean retention/residence time - MRT); diện lích dưới đường cong nồng độ tích lũy - thời gian (area under the moment curve — AUMC)...

3.3 Tính toán sinh khả dụng

Nghiên cứu đơn liều: Sinh khả dụng F được tính toán lần lượt bằng cách sử dụng AUC_0-tn và AUC_0-∞ của mỗi cá thể, đồng thời tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn. Khi liều của thuốc thử (T) giống với liều của thuốc đối chứng (R):

Khi liều thuốc thử khác với liều thuốc đối chứng và chất được phân tích đặc trưng cho dược động học tuyến tính, chỉ số F có thể thay đổi phụ thuộc vào liều và được thể hiện dưới đây:

Trong đó: D_R và D_T là liều uống của thuốc đối chứng và thuốc thử. Phân tích các chất chuyển hóa: Một vài thuốc là dạng tiền chất của thuốc không thể định lượng được trong máu vì dạng tiền chất của thuốc chuyển hóa rất nhanh trong cơ thể. Sinh khả dụng của những loại thuốc này có thể được đánh giá qua đáp ứng thích hợp của chất chuyển hóa có hoạt tính.

Trong đó: m là ký hiệu cho chất chuyển hóa. Đánh giá kết quả chủ yếu dựa vào số liệu AUC_0-tn và AUC_0-∞, được dùng như một số liệu để tham khảo.

Nghiên cừu đa liều: Sinh khả dụng F được tính toán dựa trên số liệu AUC^ss_0-t của mỗi cá thể. Khi liều của thuốc thử (T) giống với liều cùa thuốc đối chứng (R), sinh khả dụng ở trạng thái ổn định được xác định bằng công thức:

Trong đó: AAUC^ss_0-t là diện tích dưới đường cong nồng độ thuốc - thời gian từ thời điểm 0 đến thời điểm t trong suốt khoảng liều ở trạng thái ổn định.

3.4 Đánh giá tương đương sinh học (phân tích thống kê các số liệu dược động học)

Phân tích thống kê và đánh giá tương đương sinh học nên tập trung vào các thông số dược động học chính (AUC, C_max và T_max). Các giá trị C_max  và AUC phải chuyển đổi sang giá trị thang logarit. Phân tích phương sai (ANOVA) xác định ảnh hưởng của cảc yếu tố như trình tự/phác đồ sử dụng thuốc, cá thể, thuốc, giai đoạn thử thuốc... tới kết quả của nghiên cứu tương đương sinh học bằng phương pháp phân tích thống kê phù hợp tương ứng với mô hình nghiên cứu đã sử dụng (nghiên cứu song song, chéo 2 x 2; chéo 3 x 3 hay nghiên cứu lập lại...). Từ kết quả phân tích phương sai, xác định khoảng tin cậy 90 % cho tỷ lệ lnC_max và khoảng tin cậy 90 % cho tỷ lệ lnAUC giữa thuốc thử và thuốc đối chứng tương ứng của mồi người tình nguyện theo phương pháp thống kê phù hợp (two one-sided test với độ tin cậy α = 0,1). So sánh giá trị T_max của thuốc thử và thuốc đối chứng (số liệu không chuyển sang thang logarit) bằng một trong các phương pháp thống kê phi tham số Wilcoxon signed rank test, Friedman test, Kruskal-Wallis test, ANCOVA hoặc một phương pháp thống kê phi tham số khác phù hợp với mô hình nghiên cứu đă sử dụng.

Nếu giới hạn khoảng tin cậy 90% của các tỷ số C_max, AUC_0-tn, AUC_0-∞, (nghiên cứu đơn liều) hoặc C^ss_max, AUC^ss_0-t (nghiên cứu đa liều) tương ứng giữa thuốc thử và thuốc đối chứng nằm trong khoảng 80,0 % đến 125,0 % và giá trị T_max của thuốc thử và thuốc đối chứng khác nhau không có ý nghĩa thống kê thì thuốc thử tương đương sinh học in vivo so với thuốc đối chứng.

Chấp nhận hai thuốc có giới hạn khoảng tin cậy 90 % tương ứng của các tỷ số Cmax và AUC nằm trong khoảng 80,0 % đến 125,0 % và T_max khác nhau có ý nghĩa thống kê tương đương sinh học in vivo nếu sự khác nhau về tốc độ hấp thu (giá trị T_max) của thuốc thử so với thuốc đối chứng là có chủ đích và chủ đích này được trình bày trên nhấn của sản phẩm theo đúng các quy định liên quan hoặc cung cấp thêm được bằng chứng lâm sàng phù hợp cho thay sự khác nhau về tốc độ hấp thu của thuốc thử không ảnh hưởng đến an toàn và hiệu quả điều trị của thuốc trên lâm sàng.

Đối với một số thuốc/dược chất có khoảng điều trị hẹp, khoảng chấp nhận đối với khoảng tin cậy 90 % của tỷ số C_max và/hoặc AUC có thể phải thu nhỏ hơn (chỉ từ 90 % đến 110 %) so với khoảng chấp nhận thông thường từ 80 % đến 125 %. Cơ quan quản lý sẽ có quy định cụ thể trong trường hợp này. Ngoài ra, đối với các thuốc/dược chất không thuộc nhóm có khoảng điều trị hẹp, có mức độ dao động các thông số được động học trên đối tượng sử dụng lớn, có thể xem xét mở rộng khoảng chấp nhận đối với khoảng tin cậy 90 % của tỷ số C_max rộng hơn so với khoảng chấp nhận thông thường 80 % - 125 %, có thể mở rộng tới 15 % - 133 % hoặc 70 % -143 %. Cơ quan quản lý sẽ xem xét từng trường hẹp và quy định cụ thể cho các trường hợp thay đổi khoảng giới hạn chấp nhận đối với khoảng tin cậy 90 % của tỷ số C_max.

Đối với nghiên cứu sinh khả dụng/tương đương sinh học của một thuốc thử dạng bào chế tác dụng kéo đài (phóng thích hoạt chất kéo dài) so với một thuốc đối chứng dạng bào chế quy ước, mức độ hấp thu của 2 thuốc trong nghiên cứu là tương đương sinh học với nhau nếu giá trị AUC đáp ứng được những yêu cầu của tương đương sinh học (khoảng tin cậy 90 % của tỷ sổ lnAUC nằm trong giới hạn từ 80,0 % đến 125,0 %) và thuốc thử có khả năng giải phóng dược chất có kiểm soát hoặc kéo dài so với thuốc đối chứng (giá trị C_max giảm và T_max kéo dài hơn thuốc đối chứng; giá trị DF/τ của thuốc thử phải lớn hơn 143 % giá trị của thuốc đối chứng).