Các kỹ thuật ELISA (Phương pháp miễn dịch gắn men, phương pháp ELISA)

1 Nguyên tắc

Nguyên tắc chung: Các kỹ thuật ELISA, đôi khi còn được gọi là EIA, rất đa dạng. Đặc điểm chung là dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzym. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphat, TMB, ABTS), enzym sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu hoặc tín hiệu của chất phát quang chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên. Thông qua cường độ màu và cường độ sáng phát ra, ta có thể biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.

Các kỹ thuật ELISA có độ nhạy khá cao và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA), kỹ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác tương đương. ELISA được dùng để phát hiện và định lượng nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và các chất có bản chất là peptide, protein, kháng thể, hormone... Kỹ thuật này còn được sử dụng nhiều trong kiểm tra công hiệu, nhận dạng vắc xin và sinh phẩm; định lượng hàm lượng các chất tồn dư trong vắc xin có bản chất là protein như: BSA, ovalbumin, Gentamicin, Neomycin...

Kỹ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu. Phản ứng cần có hoạt tính xúc tác của enzym và thực hiện qua hai bước:

Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể.

Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzym, làm giải phóng oxy nguyên tử (H2O₂) để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, từ đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thử nghiệm.

Nguyên tắc thực hiện thử nghiệm:

Sử dụng kit ELISA chuyên dụng: Phải tuân thủ đầy đủ các bước cơ bản của quy trình theo hướng dẫn sử dụng, đánh giá thử nghiệm của từng bộ kit.

Quy trình ELISA tự gắn kit: Theo Quy trình thao tác chuẩn. Các bước cơ bản bao gồm: Pha hóa chất (kháng thể hoặc kháng nguyên) để gắn lên phiến; Nhỏ mẫu lên phiến chuyên dụng; Ủ phiến; Xử lý phiến sau khi gắn, rồi cũng pha mẫu và làm các bước tương tự như quy trình của kit thương mại. Tuy nhiên, với kit tự gắn, bước rửa nên rửa bằng tay để hạn chế sự bong tróc các kháng nguyên/kháng thể đã gắn trên giếng.

Tính kết quả: Theo phần mềm chuyên dụng được công nhận.

2 Các kỹ thuật ELISA

ELISA trực tiếp: Đây là dạng đơn giản nhất trong các kỹ thuật ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt phiến và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzym). Các bước thực hiện được mô tả khái quát trong Sơ đồ 15.46.1. Chi tiết xem Quy trình 1.

2.1 Sơ đồ 15.46.1 - Các bước thực hiện trong kỹ thuật ELISA trực tiếp

Gắn kháng nguyên vào phiến ELISA.

Ủ, rửa.

Thêm kháng thể có gắn enzym.

Ủ, rửa.

Thêm cơ chất tạo màu.

Ủ, thêm dung dịch dừng phản ứng.

Đọc kết quả.

2.1.1 Ưu điểm

Đơn giản (chỉ cần kháng thể gắn enzym, cơ chất và dung dịch dừng phản ứng).

Nhanh (chỉ vài bước đã có kết quả).

Hạn chế xảy ra phản ứng chéo vì chỉ sử dụng một loại kháng thể duy nhất.

2.1.2 Nhược điểm

Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thông thường kháng nguyên có ít nhất 2 epitope (vị trí trình diện kháng nguyên), mà phương pháp này chỉ sử dụng một kháng thể gắn vào một epitope.

Phản ứng miễn dịch của kháng thể sơ cấp bị hạn chế bởi việc gắn với enzym đánh dấu hoặc các đuôi. Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng nên mất thời gian và tốn kém. Không phù hợp cho các vắc xin đa týp. Từ những ưu và nhược điểm trên, phương pháp này thường được dùng để phát hiện nhanh kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm và rất ít được lựa chọn trong việc định lượng.

ELISA gián tiếp Trong kỹ thuật này, kháng thể kết hợp với kháng nguyên không được gắn enzym mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzym). Các bước thực hiện được mô tả khái quát trong Sơ đồ 15.46.2. Chi tiết xem Quy trình II.

2.2 Sơ đồ 15.46.2 - Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp

Gắn kháng nguyên vào phiến ELISA.

Ủ, rửa.

Thêm kháng thể sơ cấp.

Ủ, rửa.

Thêm kháng thể thứ cấp có gắn enzym.

Ủ, rửa.

Thêm cơ chất tạo màu.

Ủ, thêm dung dịch dừng phản ứng.

Đọc kết quả.

2.2.1 Ưu điểm

Kháng thể gắn enzym có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên (nhất là các vắc xin đa týp) nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa.

Phản ứng miễn dịch của kháng thể sơ cấp không bị hạn chế bởi nó không gắn với enzym đánh dấu hoặc các đuôi.

Độ nhạy và độ đặc hiệu được tăng lên vì mỗi kháng thể sơ cấp có chứa nhiều epitope có thể gắn với kháng thể thứ cấp được đánh dấu enzym.

2.2.2 Nhược điểm

Độ đặc hiệu của từng kháng thể là khác nhau. Điều này dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thử nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng thể khác nhau để kết quả có thể tin cậy.

Phản ứng chéo có thể diễn ra với kháng thể thứ cấp, tạo phản ứng không đặc hiệu (dương tính giả cao). Quy trình kéo dài thêm một bước ủ.

Từ những ưu và nhược điểm trên, phương pháp này thường được dùng để phát hiện nhanh kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm và rất ít được lựa chọn trong việc định lượng. Nếu định lượng, nên sử dụng ELISA sandwich.

ELISA Sandwich Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy. Được gọi là “sandwich” do kết quả thử nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt giữ (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies). Kỹ thuật này cũng được phân làm hai dạng là ELISA sandwich trực tiếp (DAS-ELISA) và ELISA sandwich gián tiếp (TAS-ELISA).

1) ELISA Sandwich trực tiếp (DAS-ELISA) DAS-ELISA gồm sự gắn thụ động của kháng thể vào pha rắn (đáy giếng). Sau khi ủ và rửa, các giếng được bổ sung dung dịch bão hòa phiến (blocking buffer hay saturation) thích hợp để phủ kín các vị trí còn trống trên giếng sau khi gắn kháng thể. Dung dịch bão hòa phiến thường là PBS 10 mM - 1% BSA - 0,05% tween 20; hoặc PBS 10 mM - 1% Casein - 0,05% tween 20; hoặc PBS 10 mM - 0,025% Tween 20 - 2% sữa tách béo; hoặc PBS 10 mM - 0,05% Tween 20 - 2% gelatin cá. Những thành phần của dung dịch bão hòa phiến không được chứa bất kỳ kháng nguyên nào có thể kết hợp với kháng thể bắt giữ. Sau đó, cho mẫu thử chứa kháng nguyên vào và để phản ứng kháng nguyên-kháng thể xảy ra. Những kháng nguyên được pha loãng trong dung dịch bão hòa phiến nhằm ngăn sự dính không chuyên biệt của chúng vào pha rắn. Sau khi ủ và rửa, chỉ còn phức hợp kháng nguyên - kháng thể dính vào pha rắn. Kháng thể bắt giữ có gắn enzym sau đó được thêm vào và sẽ kết hợp trực tiếp với kháng nguyên đích. Kháng thể thứ hai này có thể giống kháng thể thứ nhất (kháng thể phát hiện) hoặc khác về nguồn động vật hoặc loài động vật sản xuất kháng thể. Sau khi ủ và rửa, thêm cơ chất vào và đọc kết quả trên máy đo quang phổ.

Chú ý: Nếu sử dụng kháng thể bắt giữ và kháng thể phát hiện giống nhau, có thể dẫn đến vấn đề nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện. Mối quan hệ về kích thước và vị trí không gian của các epitope cũng có ảnh hưởng đến thử nghiệm. Chi tiết xem Quy trình III A và III B.

Các bước thực hiện được mô tả khái quát trong Sơ đồ 15.46.3:

Gắn kháng thể thứ I vào phiến ELISA.

1. Ủ, rửa.
2. Thêm kháng nguyên.
3. Ủ, rửa.
4. Thêm kháng thể có gắn enzym.
5. Ủ, rửa.
6. Thêm cơ chất tạo màu.
7. Ủ, thêm dung dịch dừng phản ứng.
8. Đọc kết quả.

Sơ đồ 15.46.3 - Các bước thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp

Trong sơ đồ 15.46.3, có thể thay kháng thể bằng kháng nguyên, khi đó sẽ sử dụng kháng kháng thể gắn enzym. Biotin được sử dụng như một kháng kháng thể chống lại kháng nguyên đích. Để phát hiện Biotin, thường dùng streptavidin hoặc avidin gắn enzym tạo phức hợp: Kháng thể-Biotinylate-Streptavidin-Enzym. Phương pháp này được áp dụng trong sản xuất các kit chẩn đoán HIV, HCV...

Một số loại kit thương phẩm để rút ngắn thời gian, sau bước nhỏ kháng nguyên sẽ nhỏ luôn kháng thể có gắn enzym vào rồi ủ. Như vậy sẽ giảm bớt được một bước ủ. Phương pháp này được ứng dụng trong sản xuất các kit thương phẩm để định lượng BSA, Ovalbumin tồn dư trong vắc xin hoặc trong thử nghiệm kiểm tra hàm lượng HBsAg trong các vắc xin viêm gan B (thử nghiệm kiểm tra công hiệu, nhận dạng in vitro).

Ưu điểm:

Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau.

Nhược điểm:

Vì sử dụng một kháng thể gắn kết với enzym nên hệ thống bị giới hạn về tính chuyên biệt và những thành phần gắn liền với kháng thể chuyên biệt. Điều này giới hạn sự linh hoạt của phương pháp, ví dụ như mỗi kháng thể được sử dụng phải được đánh dấu riêng cho những kháng nguyên khác nhau. Theo cách này, DAS-ELISA bị giới hạn về sự chuẩn bị kháng thể. Hệ thống cũng bị giới hạn ở chỗ kháng nguyên phải có ít nhất hai epitope vì cả hai kháng thể bắt giữ và phát hiện đều kết hợp trực tiếp với kháng nguyên.

Kháng thể bắt giữ trên pha rắn và kháng thể phát hiện có thể chống lại những epitope khác nhau trên phức hợp kháng nguyên. Do đó, thuận lợi khi khảo sát sự khác biệt nhỏ giữa những kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể phát hiện và kháng thể bắt giữ khác nhau.

2) ELISA Sandwich gián tiếp:

Ứng dụng trong thử nghiệm kiểm tra vắc xin đa týp như vắc xin phòng papillomavirus (Gardasil, Cervarix), IPV (bại liệt bất hoạt). Các bước thực hiện được mô tả khái quát trong Sơ đồ 15.46.4.

Biotin được sử dụng như một kháng kháng thể thứ II. Kháng kháng thể thứ hai này có vai trò bắt giữ không cho kháng thể thứ II có gắn enzym bị rửa trôi. Để phát hiện các protein được biotinylated, người ta thường sử dụng streptavidin hoặc avidin, hai loại protein có phản ứng tạo ái lực cao với các phân tử protein được biotinylated. Enzym HRP thường được gắn cộng hợp với streptavidin hoặc avidin. Việc sử dụng biotin như một kháng kháng thể thứ II chung cho các vắc xin/chủng virus, vi khuẩn đa týp có nhiều lợi ích, giảm kinh phí và thời gian cho việc tạo liên kết giữa enzym với từng kháng thể II chuyên biệt. Ngoài ra, phương pháp này chuyên biệt hơn ELISA sandwich trực tiếp do kháng thể được gắn enzym không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên.

Phương pháp này có ưu điểm vượt trội hơn hẳn so với các phương pháp khác, nên thường được chọn để định tính các týp trong các vắc xin đa giá hoặc bệnh virus, vi khuẩn đang nghiên cứu (chưa rõ týp nào).

Sơ đồ 15.46.4 - Các bước thực hiện ELISA Sandwich gián tiếp:

1. Gắn kháng thể thứ I vào phiến ELISA.
2. Ủ, rửa.
3. Thêm kháng nguyên.
4. Ủ, rửa.
5. Thêm kháng thể thứ II.
6. Ủ, rửa.
7. Bổ sung kháng kháng thể thứ II có gắn enzym.
8. Ủ, rửa.
9. Thêm cơ chất tạo màu.
10. Ủ, thêm dung dịch dừng phản ứng.
11. Đọc kết quả.

2.3 ELISA ức chế hoặc cạnh tranh

ELISA cạnh tranh (competition ELISA) là thí nghiệm ELISA, trong đó hai chất tham gia phản ứng cùng ái lực bắt cặp với chất thứ ba. Trong phép thử ELISA cạnh tranh (phản ứng cạnh tranh), hai chất cạnh tranh phải được đưa vào đồng thời.

Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh: Cả hai phản ứng đều có sự tham gia của hai kháng thể phản ứng với kháng nguyên. Nếu một kháng thể được ủ trước phản ứng, đó được gọi là ức chế (blocking/inhibition assays). Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa cả hai kháng thể được thêm vào đồng thời với nhau (Hình 15.46.1).

Hình 15.46.1 - Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh

2.4 ELISA cạnh tranh trực tiếp (Direct C-ELISA) kiểm tra kháng nguyên

Trong hệ thống trực tiếp, lượng kháng nguyên trên bề mặt phiến và lượng kháng thể gắn enzym đã được chuẩn độ để tối ưu. Kháng nguyên và kháng thể gắn enzym được thêm vào phiến cùng một lúc để tạo ưu thế cạnh tranh.

Nếu kháng nguyên tương tự hoặc cùng loại như kháng nguyên đã được gắn trên phiến, thì kháng thể gắn enzym sẽ gắn lên kháng nguyên này. Khi nồng độ của kháng nguyên cạnh tranh cao, sẽ ngăn cản bất kỳ sự kết hợp nào của kháng thể gắn enzym với kháng nguyên trên bề mặt phiến (cạnh tranh 100%). Nếu nồng độ kháng nguyên cạnh tranh giảm (ví dụ do pha loãng), sự cạnh tranh sẽ giảm. Như vậy, nồng độ kháng nguyên cạnh tranh càng cao thì độ hấp thu màu càng giảm. Kháng nguyên cạnh tranh có thể được thêm trực tiếp vào đĩa nếu nó được pha loãng trong dung dịch bão hòa phiến trước khi thêm kháng thể gắn enzym.

Mức độ cạnh tranh theo thời gian phụ thuộc vào mối tương quan của nồng độ phản ứng cần kiểm tra và kháng nguyên trên bề mặt phiến (và mức độ tương đồng của kháng nguyên). Sau khi ủ và rửa, lượng kháng thể có đánh dấu được định lượng sau khi thêm cơ chất. Khi không có kháng nguyên trong mẫu kiểm tra hay không có sự tương đồng của kháng nguyên, thì không có sự gắn kết với kháng thể được đánh dấu và không có sự cạnh tranh với kháng nguyên này. Kết quả là mẫu có chứa kháng nguyên sẽ làm giảm cường độ màu, còn đối chứng âm thì không.

ELISA cạnh tranh trực tiếp kiểm tra kháng nguyên được mô tả ở Sơ đồ 15.46.5.

Ag: kháng nguyên; Ab: kháng thể; Enz: Enzym gắn cộng hợp; S: cơ chất

Sơ đồ 15.46.5 - ELISA cạnh tranh trực tiếp kiểm tra kháng nguyên

ELISA cạnh tranh trực tiếp (Direct C-ELISA) kiểm tra kháng thể

Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể tương tự với Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên. Sự cạnh tranh ở đây là giữa kháng thể trong mẫu và kháng thể được đánh dấu với các vị trí trên kháng nguyên gắn sẵn trên phiến. Mẫu và kháng thể đánh dấu được trộn với nhau trước khi thêm vào phiến.

Phương pháp này được ứng dụng trong sản xuất các kit thương phẩm định lượng hàm lượng kháng thể của virus viêm gan A, viêm gan B trong huyết thanh. Sử dụng nhiều trong kiểm tra công hiệu vắc xin viêm gan A, B theo phương pháp in vivo. Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể được mô tả chi tiết ở Sơ đồ 15.46.6.

Ag: kháng nguyên; Ab: kháng thể; AB: kháng thể khác loại hoặc khác nguồn gốc với Ab; Enz: Enzym gắn cộng hợp; S: cơ chất

Sơ đồ 15.46.6 - ELISA cạnh tranh trực tiếp kiểm tra kháng thể

ELISA cạnh tranh gián tiếp (Indirect C-ELISA)

Nguyên lý: Đầu tiên, gắn một lượng kháng nguyên trùng với kháng nguyên cần kiểm tra lên phiến. Sau đó thêm kháng nguyên cần kiểm tra (pha ra một số nồng độ) và kháng thể đặc hiệu. Kháng nguyên cần kiểm tra sẽ phản ứng cạnh tranh với kháng nguyên đã gắn trên phiến. Sau đó thêm kháng thể thứ hai có gắn enzym, ủ, rửa và thêm cơ chất. Thêm dung dịch dừng phản ứng và đọc kết quả OD. Giá trị OD sẽ tỷ lệ nghịch với hàm lượng kháng nguyên có trong mẫu, tức là mẫu có nồng độ kháng nguyên cao sẽ cho giá trị OD thấp và ngược lại, vì thường thì phản ứng giữa kháng nguyên tự do với kháng thể xảy ra trước rồi mới đến phản ứng giữa kháng nguyên gắn trên phiến với kháng thể.

Phương pháp này được áp dụng trong quá trình xác định công hiệu thành phần HBsAg của vắc xin viêm gan A-B phối hợp. Một số kit thương phẩm dùng để định lượng hàm lượng kháng sinh tồn dư trong vắc xin như gentamicin, neomycin.

3 HƯỚNG DẪN XỬ TRÍ CÁC VẤN ĐỀ THƯỜNG GẶP TRONG THỬ NGHIỆM ELISA (xem Bảng 15.46.1)

Bảng 15.46.1 - Các vấn đề thường gặp, nguyên nhân và hướng dẫn xử trí

(*): Các loại cơ chất và bước sóng phù hợp

Ngoài ra, để đảm bảo kết quả ELISA được chuẩn xác và ít bị nhiễu thì cần phải đặc biệt chú ý đến các vấn đề về dụng cụ, thiết bị, thao tác trong thử nghiệm.

Yêu cầu đối với dụng cụ, thiết bị sử dụng trong thử nghiệm ELISA:

Dàn máy ELISA phải được hiệu chuẩn, bảo dưỡng định kỳ.

Dụng cụ làm ELISA có rất nhiều, trong đó đặc biệt chú ý là pipetman (các loại đơn và đa kênh) phải được hiệu chuẩn định kỳ. Cách hiệu chuẩn như sau: Mỗi loại pipetman chọn 3 khoảng thể tích để hiệu chuẩn (thấp nhất, ở giữa và cao nhất). Ví dụ, pipet loại (10 - 100) µl thì sẽ chọn thể tích để chuẩn định ở 10 µl, 50 µl và 100 µl. Tại mỗi thể tích sẽ đo 10 lần rồi tính độ lệch chuẩn CV (%). Tiêu chuẩn cho pipet được phép sử dụng làm ELISA: tại độ tin cậy 95%, CV < (2 - 3)%. Ngoài khoảng này không được phép sử dụng. Với pipet đa kênh, việc hiệu chuẩn cũng tiến hành tương tự trên từng kênh. Pipet đa kênh chỉ được sử dụng khi tất cả các kênh đều đạt yêu cầu về độ lệch chuẩn quy định (tại độ tin cậy 95%, CV < 2 - 3%).

Các dụng cụ đựng hóa chất (chai lọ, tuýp pha loãng hoặc các máng nhựa...): Phải được đánh dấu và tách riêng một bộ.

Cách thao tác khi hút mẫu sử dụng pipetman (ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả thử nghiệm):

Gắn thật chặt các đầu côn vào pipet. Nên sử dụng pipet và đầu côn đúng chủng loại, tránh tình trạng đầu côn của một hãng, pipet của một hãng khác.

Tráng đầu côn vài lần bằng cách hút lên xuống để tránh sai số do sức căng bề mặt của nước.

Hút 2 kỳ, nhả 1 kỳ. Hút phải từ từ để chất lỏng lên đều đạt trạng thái cân bằng về thể tích và không tạo bọt khí ở giữa.

Nhả từ từ về 1 kỳ. Khi nhả, nghiêng đầu côn về vị trí của giếng, không chạm sát dung dịch có sẵn trong giếng hoặc đáy giếng để tránh lượng chất lỏng trong giếng bám vào bên ngoài đầu côn gây sai số.

Thay đổi đầu côn khi thay đổi độ pha hoặc hóa chất.

Sử dụng pipet trong giới hạn khuyến cáo. Ví dụ, giới hạn của pipet là (10 - 100) µl thì không sử dụng để hút các thể tích < 10 µl hoặc > 100 µl.

Nếu hóa chất có độ nhớt thì hút từ từ để thể tích về trạng thái cân bằng mới nhấc ra khỏi dịch lỏng.

Trong khi hút, nếu thấy có bọt khí thì phải hút lại. Hút lại vài lần vẫn còn bọt khí thì phải thay đầu côn mới.

Cách pha loãng mẫu để giảm sai số:

Tránh pha loãng nhiều bước. Ví dụ, nếu pha 1/1000 thì chỉ nên pha 2 bước:

Bước 1: Pha 1/100 (1 ml mẫu + 99 ml dung dịch pha loãng).

Bước 2: Lấy 1 ml của độ pha 1/100 + 9 ml dung dịch pha loãng.

Tránh sử dụng thể tích mẫu quá ít khi pha loãng mẫu. Mẫu phân tích nếu có hàm lượng không quá cao ở mức nguyên chất hoặc đậm đặc; mẫu có nhiều thành phần tá chất, tá dược, chất bảo quản, protein tạp khác như vắc xin, sinh phẩm thì nên sử dụng lượng thể tích theo đơn vị ml. Ví dụ, mẫu cần pha 1/100 thì không nên pha: 1 ml mẫu + 99 ml dung dịch pha loãng mà nên pha lượng thể tích nhiều hơn: 5 ml mẫu + 495 ml dung dịch pha loãng.

Các mẫu có độ tinh sạch và nồng độ đậm đặc cao, hàm lượng hàng trăm đến hàng nghìn µg/ml: Nồng độ mẫu cần dùng chỉ 1 µg/ml thì khi pha không nên lấy thể tích dưới 2 µl (< 2 µl), nên lấy từ 10 µl trở lên.

Pha loãng mẫu trên tuýp Nhựa hoặc tuýp thủy tinh: Dụng cụ pha phải thật sạch; trộn, lắc kỹ trước khi hút; thay đầu côn khi chuyển độ pha hoặc hóa chất.

Pha loãng mẫu trên phiến 96 giếng: Phải sử dụng pipet đa kênh đạt chuẩn. Thao tác như sau: Trộn mẫu bằng cách hút lên xuống vài lần (4 đến 5 lần) rồi hút lượng hóa chất cần lấy và chuyển sang độ pha loãng cao hơn kế tiếp.

Lưu ý:

Thao tác đều tay, tránh bọt khí, tránh thể tích không đều giữa các kênh và không đồng đều về số lần trộn... dẫn đến sai số hệ thống hoặc sai số ở một hoặc một số độ pha.

Trong thời gian trộn có thể xảy ra phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể, hoặc phản ứng hấp phụ lên phiến pha mẫu dẫn đến làm mất (thiếu) đi một lượng chất phản ứng nhất định. Để tránh điều này, nên sử dụng các dụng cụ pha loãng có khả năng hấp phụ kém như polypropylene hoặc thủy tinh, hoặc khi chuyển độ pha thì hút đồng thời vào phiến thử nghiệm luôn. Ví dụ, cần pha loãng bậc 5 ra 10 độ pha, khi pha mẫu từ độ pha 5¹ sang 5² mà độ pha 5¹ cũng sử dụng trong thử nghiệm thì khi hút mẫu từ 5¹ sẽ hút luôn cả mẫu vào phiến thử nghiệm. Cách làm sẽ tương tự trong suốt quá trình pha loãng.

Ví dụ về một số quy trình thực hiện kỹ thuật ELISA

Nguyên vật liệu, dụng cụ và thiết bị:

Kháng nguyên.

Kháng thể cộng hợp gắn enzym.

Dung dịch đệm pha loãng kháng nguyên.

Dung dịch block (cố định) phiến.

Dung dịch rửa.

Dung dịch cơ chất.

Dung dịch dừng phản ứng.

Giàn máy ELISA.

Pipetman các loại.

Đầu côn các loại từ 10 µl đến 1000 µl.

Máng nhựa.

Phiến ELISA chuyên dụng: Phiến 96 giếng đáy tròn (để pha loãng mẫu).

Ống eppendorf 1,5 ml đến 2 ml.

Chai thủy tinh các loại từ 100 ml đến 1000 ml.

Giấy dán phiến.

Tủ lạnh.

Tủ ấm 37 °C.

Các quy trình:

QUY TRÌNH I: ELISA trực tiếp (Direct ELISA Representative Protocol)

 Gắn phiến:

Nhỏ 100 µl kháng nguyên đã pha loãng (có hàm lượng từ 1 µg/ml đến 20 µg/ml) trong dung dịch đệm phù hợp vào mỗi giếng của phiến gắn ELISA chuyên dụng.

Ủ ở 2 °C đến 8 °C qua đêm (khoảng 16h đến 18h).

 Cố định phiến sau gắn:

Đổ hết dung dịch trong phiến.

Thêm 300 µl dung dịch bão hòa vào các giếng, ủ 1-2 giờ ở nhiệt độ phòng. Nếu cần làm ngay, ủ ở 37 °C trên máy lắc nhẹ trong 15 phút.

Rửa sạch phiến bằng dung dịch rửa (PBS 0,05% Tween 20) 3-5 lần, mỗi lần khoảng 300-500 µl/giếng. Lần rửa cuối ngâm 10 phút.

Thêm kháng thể cộng hợp gắn enzym:

Thêm 100 µl kháng thể cộng hợp gắn enzym vào tất cả các giếng.

Dán phiến và ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ (tốt nhất ủ ở 37 °C).

Đổ hết dung dịch và rửa phiến 3-5 lần, mỗi lần khoảng 300-500 µl/giếng. Lần rửa cuối ngâm 10 phút.

Thêm cơ chất:

Nhỏ 100 µl dung dịch cơ chất vào mỗi giếng.

Ủ ở nhiệt độ phòng (25-28 °C) trong 10-20 phút.

Thêm 100 µl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng.

Đọc kết quả OD trên máy đọc ELISA chuyên dụng trong vòng 30 phút.

Tuỳ theo loại cơ chất sử dụng trong thử nghiệm để chọn bước sóng phù hợp.

QUY TRÌNH II: ELISA gián tiếp (Indirect ELISA Representative Protocol) quy trình tự gắn phiến

Gắn phiến:

Nhỏ 100 µl kháng nguyên đã pha loãng (1-20 µg/ml) trong dung dịch đệm phù hợp vào mỗi giếng của phiến gắn ELISA chuyên dụng.

Ủ ở 2 °C đến 8 °C qua đêm (16-18 giờ).

Cố định phiến sau gắn:

Đổ hết dung dịch trong phiến.

Thêm 300 µl dung dịch bão hòa vào các giếng, ủ 1-2 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc ủ ở 37 °C trong 15 phút nếu cần làm nhanh.

Rửa sạch phiến bằng dung dịch rửa 3-5 lần, mỗi lần 300-500 µl/giếng. Lần rửa cuối ngâm 10 phút.

Thêm kháng thể 1 (primary antibody):

Thêm 100 µl kháng thể không gắn enzym vào tất cả các giếng.

Dán phiến và ủ ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ (tốt nhất ủ ở 37 °C).

Đổ hết dung dịch và rửa phiến 3-5 lần, mỗi lần 300-500 µl/giếng. Lần rửa cuối ngâm 10 phút.

Thêm kháng thể 2 cộng hợp gắn enzym:

Thêm 100 µl kháng thể cộng hợp gắn enzym vào tất cả các giếng.

Dán phiến và ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ (tốt nhất ủ ở 37 °C).

Đổ hết dung dịch và rửa phiến 3-5 lần, mỗi lần 300-500 µl/giếng. Lần rửa cuối ngâm 10 phút.

Thêm cơ chất:

Nhỏ 100 µl cơ chất vào mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng (25-28 °C) trong 15-30 phút.

Thêm 100 µl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng.

Đọc kết quả OD trên máy đọc ELISA trong vòng 30 phút từ khi nhỏ dung dịch dừng phản ứng. 

Tuỳ theo loại cơ chất sử dụng trong thử nghiệm để chọn bước sóng phù hợp.

QUY TRÌNH III A: ELISA Sandwich trực tiếp (Direct Sandwich/Capture ELISA Representative Protocol) quy trình tự gắn phiến

Gắn phiến:

Nhỏ 100 µl kháng thể 1 (capture antibody) đã pha loãng (1-15 µg/ml) vào mỗi giếng của phiến ELISA chuyên dụng.

Ủ ở 2 °C đến 8 °C qua đêm (16-18 giờ).

Cố định phiến sau gắn:

Đổ hết dung dịch trong phiến.

Thêm 300 µl dung dịch bão hòa vào các giếng.

QUY TRÌNH III B: ELISA Sandwich gián tiếp (Indirect Sandwich/Capture ELISA Representative Protocol), quy trình tự gắn phiến

Gắn phiến:

Nhỏ 100 µl kháng nguyên đã pha loãng (có hàm lượng từ 1 - 20 µg/ml) trong dung dịch đệm phù hợp vào mỗi giếng của phiến gắn ELISA chuyên dụng.

Ủ ở 2 °C đến 8 °C qua đêm (khoảng 16 giờ đến 18 giờ).

Cố định phiến sau gắn:

Đổ hết dung dịch trong phiến.

Thêm 300 µl dung dịch bão hòa vào các giếng.

Ủ từ 1 giờ đến 6 giờ ở nhiệt độ phòng. Trường hợp làm ngay và để rút ngắn thời gian, ủ ở 37 °C trên máy lắc nhẹ trong 15 phút đến 60 phút là có thể thực hiện được. Nếu chưa làm ngay có thể ngâm lâu hơn.

Rửa sạch phiến bằng dung dịch rửa (thường là PBS - 0,05% Tween 20) 3 lần đến 5 lần, mỗi lần khoảng 300 - 500 µl/giếng. Lần rửa cuối ngâm 10 phút.

Thêm kháng nguyên của mẫu:

Thêm 100 µl kháng nguyên của mẫu thử vào tất cả các giếng.

Dán phiến và ủ ở nhiệt độ phòng từ 1 giờ đến 2 giờ (tốt nhất ủ ở 37 °C).

Đổ hết dung dịch có trong giếng và rửa phiến bằng dung dịch rửa 3 lần đến 5 lần, mỗi lần khoảng 300 - 500 µl/giếng. Lần rửa cuối ngâm 10 phút.

Thêm kháng thể sơ cấp:

Thêm 100 µl kháng thể 2 vào tất cả các giếng.

Dán phiến và ủ ở nhiệt độ phòng từ 1 giờ đến 2 giờ (tốt nhất ủ ở 37 °C).

Đổ hết dung dịch có trong giếng và rửa phiến bằng dung dịch rửa 3 lần đến 5 lần, mỗi lần khoảng 300 - 500 µl/giếng. Lần rửa cuối ngâm 10 phút.

Thêm kháng thể 2 cộng hợp gắn enzym:

Thêm 100 µl kháng thể cộng hợp gắn enzym vào tất cả các giếng.

Dán phiến và ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ (tốt nhất ủ ở 37 °C). Một số phản ứng có thể phải ủ từ 3 giờ đến 4 giờ để đạt tối ưu.

Đổ hết dung dịch có trong giếng và rửa phiến bằng dung dịch rửa 3 lần đến 5 lần, mỗi lần khoảng 300 - 500 µl/giếng. Lần rửa cuối ngâm 10 phút.

Thêm cơ chất:

Nhỏ 100 µl dung dịch cơ chất vào mỗi giếng.

Ủ ở nhiệt độ phòng (25 °C đến 28 °C) trong 15 phút đến 30 phút, tránh ánh sáng.

Thêm 100 µl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng.

Đọc kết quả OD trên máy đọc ELISA chuyên dụng. Thời gian đọc không quá 30 phút từ khi nhỏ dung dịch dừng phản ứng.

Tùy theo loại cơ chất sử dụng trong thử nghiệm để chọn bước sóng phù hợp.