Bacitracin

Bacitracin là hỗn hợp các polypeptid kháng khuẩn được tạo ra bởi một số loài Bacillus licheniformis hoặc Bacillus subtilis, thành phần chủ yếu là bacitracin A, B₁, B₂ và B_3. Phải chứa ít nhất 60 IU/mg, tính theo chế phẩm đã làm khô.

1 Tính chất

Bột trắng hoặc gần như trắng. Hút ẩm. Dễ tan trong nước và trong Ethanol 96 %.

2 Định tính

Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau:

Nhóm 1: B, C.

Nhóm II: A, C.

A. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5,4)

Bản mỏng: Silica gel G

Dung môi khai triển: Acid acetic băng - nước - butanol (14:29:57).

Dung dịch thử: Hòa tan 10 mg chế phẩm trong dung dịch acid hydrocloric 0,03 M (TT) và pha loãng thành 1,0 ml với cùng dung môi.

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 10 mg bacitracin Kẽm chuẩn trong dung dịch acid hydrocloric 0,03 M (TT) và pha loãng thành 1,0 ml với cùng dung môi.

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đồ cho đến khi dung môi đi được hơn 1/2 chiều dài bản mỏng. Sấy khô bản mỏng ở 100 °C đến 105 °C. Phun lên bản mỏng dung dịch ninhydrin (TT) và sấy ở 110 °C trong 5 min. Các vết trên sắc ký đồ của dung dịch thử có vị trí, kích thước và màu sắc tương tự các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

B. Chế phẩm phải đáp ứng yêu cầu phép thử Thành phần cấu trúc.

C. Nung 0,2 g chế phẩm. Cắn còn lại có màu vàng ở nhiệt độ cao với lượng không đáng kể. Để nguội. Hòa tan cắn trong 0,1 ml dung dịch acid hydrocloric loãng (TT). Thêm 5 ml nước và 0,2 ml dung dịch natri hydroxyd 10 M (TT). Không tạo tủa trắng.

3 Độ trong của dung dịch

Dung dịch S: Hòa tan 0,25 g chế phẩm trong nước không có carbon dioxyd (TT), pha loãng thành 25 ml với cùng dung môi.

Dung dịch S phải trong (Phụ lục 9.2).

4 pH

Từ 6,0 đến 7,0 (Phụ lục 6.2).

Dùng dung dịch S để đo.

5 Thành phần cấu trúc

Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dùng phương pháp chuẩn hóa để tính toán. Chuẩn bị các dung dịch ngay trước khi dùng.

Pha động: Acetonitril - dung dịch B - nước dùng cho sắc ký - methanol (TT₁) (43 : 100 : 300 : 557).

Dung dịch A: Dung dịch 40 g/l natri edetat (TT) được điều chỉnh đến pH 7,0 bằng dung dịch natri hydroxyd loãng (TT).

Dung dịch B: Hòa tan 54,4 8 Kali dihydrophosphat (TT) bằng nước dùng cho sắc ký trong bình định mức 2000 ml, thêm nước đến vạch. Điều chỉnh đến pH 6,0 bằng dung dịch dikali hydrophosphat (TT) 3,48 % và lọc qua màng lọc 0,45 μm.

Dung dịch thử: Hòa tan 0,100 g chế phẩm trong pha động và pha loãng thành 50,0 ml bằng pha động.

Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 20,0 mg bacitracin chuẩn dùng để kiểm tra tính phù hợp hệ thống trong dung dịch A và pha loãng thành 10,0 ml với cùng dung môi.

Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 5,0 ml dung dịch đối chiếu (1) thành 100,0 ml bằng dung dịch A. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 10,0 ml bằng dung dịch A.

Dung dịch đối chiếu (3): Để tạo các tạp chất E, F, G và H, làm nóng 4 ml dung dịch đối chiếu (1) trong cách thủy 30 min, để nguội về nhiệt độ phòng.

Điều kiện sắc ký:

Cột kích thước (15 cm × 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh end- capped octadecylsilyl silica gel dùng cho sắc ký (3,5 µm).

Nhiệt độ cột: (28 + 2) °C.

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm.

Tốc độ dòng: 1,0 ml/min.

Thể tích tiêm: 100 µl.

Cách tiến hành:

Tiến hành sắc ký với thời gian gấp 3 lần thời gian lưu của bacitracin A.

Tiến hành sắc ký với dung dịch thử, dung dịch đối chiếu (1) và (2).

Sử dụng sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) để xác định pic của tạp chất M và bacitracin A, B₁, B₂ và B₃ (xem Hình 1). Thời gian lưu tương đối so với bacitracin A (thời gian lưu khoảng 20 min): Tạp chất A khoảng 0,44; tạp chất B khoảng 0,52; tạp chất C khoảng 0,55; bacitracin B₁ khoảng 0,65; bacitracin B₂ khoảng 0,67; bacitracin B₃ khoảng 0,81; tạp chất M khoảng 0,87; tạp chất N khoảng 0,90; tạp chất L khoảng 0,93; tạp chất O khoảng 1,2; tạp chất P và Q khoảng 1,3; tạp chất F khoảng 1,6; tạp chất G khoảng 1,8; tạp chất H khoảng 2,1; tạp chất E khoảng 2,8. Nếu cần, điều chỉnh thành phần pha động bằng cách thay đổi thể tích dung môi hữu cơ nhưng vẫn giữ nguyên tỷ lệ methanol và acetonitril.

Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1), tỷ số đỉnh – hõm (H_p/H_v) ít nhất là 1,2 - trong đó H_p là chiều cao đỉnh pic bacitracin B₂ so với đường nền và H_v là chiều cao tính từ đường nền lên đến đáy hõm giữa pic bacitracin B₂ và pic bacitracin B1; tỷ số đđỉnh – hõm (H_p/H_v) ít nhất là 1,1 - trong đó H_p là chiếu cao đỉnh pic tạp chất M so với đường nền và H_v là chiều cao tính từ đường nền lên đến đáy hồm giữa pic tạp chất M và pic bacitracin B₃. Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2), tỷ số tín hiệu trên nhiều ít nhất là 50 đối với pic bacitracin A. Giới hạn:

Bacitracin A: Ít nhất là 45,0%

Tổng bacitracin A, B₁, B₂ và B3: Ít nhất là 77,0%. 

Ghi chú:

Bacitracin A: 4.10-anhydro[N-(4)-2-[(18,25)-1-amino-2- Tap chát D: 4,10-anhydro[N-[(4R)-2-[(15)-1-amino-2. methylbutyl-4,5-dihydro-1,3-thiazol-4-ylcarbonyl]-L-leucyl- methylpropyl]-4,5-dihydro-1,3-thiazol-4-ylcarbonyl)-L D-a-glutamyl-L-isoleucyl-L-lysyl-D-omithyl-L-isoleucyl-D- leucyl-D-a-glutamyl-L-valyl-L-lysyl-D-ornithyl-L-valyl-D phenylalanyl-L-histidyl-D-a-aspartyl-L-asparagin).

Bacitracin B₁: 4,10-anhydro[N-(4)-2-[(15)-1-amino-2-methyl- Tap chit E: 4,10-anhydro(N-112-[(25)-2-methyl-1-oxobutyl) phenylalanyl-L-histidyl-D-a-aspartyl-L-asparagin) (bacitracin E) propyl)-4,5-dihydro-1,3-thiazol-4-yl)carbonyl]-L-leucyl-D- 1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]-L-leucyl-D-a-glutamyl-L-isoleuc a-glutamyl-L-isoleucyl-L-lysyl-D-ornithyl-L-isoleucyl-D- L-lysyl-D-omithyl-L-isoleucyl-D-phenylalanyl-L-histidyl-D- phenylalanyl-L-histidyl-D-a-aspartyl-L-asparagin].

Bacitracin B₂: 4,10-anhydro[N-[[(4R)-2-[(18,25)-1-amino-2- Tap chát F: 4,10-anhydro[N-[2-(2-methyl-1-oxopropyl)-1,3. aspartyl-L-asparagin] (bacitracin F). methylbutyl-4,5-dihydro-1,3-thiazol-4-yl)carbonyl]-L-leucyl- thiazol-4-ylcarbonyl)-L-leucyl-D-a-glutamyl-L-isoleucyl-L D-a-glutamyl-L-isoleucyl-L-lysyl-D-ornithyl-L-valyl-D- lysyl-D-ornithyl-L-isoleucyl-D-phenylalanyl-L-histidyl-D-a- phenylalanyl-L-histidyl-D-a-aspartyl-L-asparagin].

Bacitracin B₃: 4,10-anhydro[N-[[(4R)-2-[(15,25)-1-amino-2- Tap chit G: 4,10-anhydro[N-([2-((25)-2-methyl-1-oxobutyl)- aspartyl-L-asparagin) (bacitracin HI). methylbutyl-4,5-dihydro-1,3-thiazol-4-yl)carbonyl)-L-leucyl- 1,3-thiazol-4-yl)carbonyl]-L-leucyl-D-a-glutamyl-L-isoleucy- D-a-glutamyl-L-valyl-L-lysyl-D-ornithyl-L-isoleucyl-D- L-lysyl-D-ornithyl-L-valyl-D-phenylalanyl-L-histidyl-D-a- phenylalanyl-L-histidyl-D-a-aspartyl-L-asparagin). aspartyl-L-asparagin]

6 Tạp chất liên quan

Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Điều kiện sắc ký như mô tả trong phần Thành phần cấu trúc. Dùng phương pháp chuẩn hóa để tính toán.

Tiến hành sắc ký với dung dịch thử, dung dịch đối chiếu (1), (2) và (3).

Sử dụng sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) để xác định pic của tạp chất A, B, C, L, M, N, O, P và Q (xem Hình 1); sử dụng sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) để xác định pic của tạp chất E, F, G và H (xem Hình 2).

Giới hạn:

Tổng tạp chất L và N: Không được quá 8,0 %

Tạp chất E: Không được quá 4,0 %.

Tạp chất A: Không được quá 3,5 %.

Tạp chất B và M: Với mỗi tạp chất, không được quá 3,0 %.

Tạp chất C: Không được quá 2,5 %.

Tổng tạp chất O, P và Q: Không được quá 2,5 %.

Tổng tạp chất F và G: Không được quá 2,0 %.

Tạp chất H: Không được quá 1,0 %.

Tạp chất khác: Không được quá 2,0 %.

Tổng các tạp chất: Không được quá 23,0 %.

Bỏ qua các tạp chất có hàm lượng dưới 0,25 %.

Ghi chú:

Tạp chất A: 4,10-anhydro[N-[[(4R)-2-[(1S)-1-amino-2-methylpropyl]-4,5-dihydro-1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]-L-leucyl- D-a-glutamyl-L-isoleucyl-L-lysyl-D-ornithyl-L-valyl-D- phenylalanyl-L-histidyl-D-a-aspartyl-L-asparagin] (bacitracin D1, bacitracin C2).

Tạp chất B: 4,10-anhydro[N-[[(4R)-2-[(15)-1-amino-2-methylpropyl)-4,5-dihydro-1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]-L-leucyl- D-a-glutamyl-L-valyl-L-lysyl-D-ornithyl-L-isoleucyl-D- phenylalanyl-L-histidyl-D-a-aspartyl-L-asparagin] (bacitracin D2, bacitracin C3).

Tạp chất C: 4,10-anhydro[N-[[(4R)2-((15,25)-1-amino-2-methylbutyl]-4,5-dihydro-1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]-L- leucyl-D-a-glutamyl-L-valyl-L-lysyl-D-ornithyl-L-valyl-D- phenylalanyl-L-histidyl-D-a-aspartyl-L-asparagin] (bacitracin D3, bacitracin C1a).

Tạp chất D: 4,10-anhydro[N-[[(4R)-2-[(15)-1-amino-2-methylpropyl]-4,5-dihydro-1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]-L. leucyl-D-a-glutamyl-L-valyl-L-lysyl-D-ornithyl-L-valyl-D. phenylalanyl-L-histidyl-D-a-aspartyl-L-asparagin] (bacitracin E).

Tạp chất E: 4,10-anhydro[N-[[2-[(2S)-2-methyl-1-oxobutyl]- 1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]-L-leucyl-D-a-glutamyl-L-isoleucyl- L-lysyl-D-ornithyl-L-isoleucyl-D-phenylalanyl-L-histidyl-D-a- aspartyl-L-asparagin] (bacitracin F).

Tạp chất F: 4,10-anhydro[N-[[2-(2-methyl-1-oxopropyl)-1,3- thiazol-4-yl]carbonyl]-L-leucyl-D-a-glutamyl-L-isoleucyl-L- lysyl-D-ornithyl-L-isoleucyl-D-phenylalanyl-L-histidyl-D-a- aspartyl-L-asparagin] (bacitracin H1).

Tạp chất G: 4,10-anhydro[N-[[2-[(2S)-2-methyl-1-oxobutyl]- 1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]-L-leucyl-D-a-glutamyl-L-isoleucyl- L-lysyl-D-ornithyl-L-valyl-D-phenylalanyl-L-histidyl-D-a- aspartyl-L-asparagin] (bacitracin H2).

Tạp chất H: 4,10-anhydro[N-[[2-[(2S)-2-methyl-1-oxobutyl]- 1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]-L-leucyl-D-a-glutamyl-L-valyl-L- lysyl-D-ornithyl-L-isoleucyl-D-phenylalanyl-L-histidyl-D-a- aspartyl-L-asparagin] (bacitracin H3).

Tạp chất I: 4,10-anhydro[N-[[2-(2-methyl-1-oxopropyl)-1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]-L-leucyl-D-a-glutamyl-L-isoleucyl- L-lysyl-D-ornithyl-L-valyl-D-phenylalanyl-L-histidyl-D-a- aspartyl-L-asparagin] (bacitracin II).

Tạp chất J: 4,10-anhydro[N-[[2-(2-methyl-1-oxopropyl)-1,3- thiazol-4-yl]carbonyl]-L-leucyl-D-a-glutamyl-L-valyl-L- lysyl-D-ornithyl-L-isoleucyl-D-phenylalanyl-L-histidyl-D-a- aspartyl-L-asparagin] (bacitracin 12).

Tap chất K: 4,10-anhydro[N-[[2-[(2S)-2-methyl-1-oxobutyl]-1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]-L-leucyl-D-a-glutamyl-L-valyl- L-lysyl-D-ornithyl-L-valyl-D-phenylalanyl-L-histidyl-D-a- aspartyl-L-asparagin] (bacitracin 13).

Tạp chất L: 4,10-anhydro[N-(((4R)-2-((1R,2S)-1-amino-2-methylbutyl]-4,5-dihydro-1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]-L-leucyl- D-a-glutamyl-L-isoleucyl-L-lysyl-D-ornithyl-L-isoleucyl-D- phenylalanyl-L-histidyl-D-a-aspartyl-L-asparagin] (bacitracin X).

Tạp chất M: 4,10-anhydro[N-[[2-[(15,25)-1-amino-2-methyl-butyl]-1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]-L-leucyl-D-a-glutamyl-L- isoleucyl-L-lysyl-D-ornithyl-L-isoleucyl-D-phenylalanyl-L-histidyl-D-a-aspartyl-L-asparagin] (bacitracin Y).

Tạp chất N: 4,10-anhydro[N-([(4S)2-((15,2S)-1-amino-2-methylbutyl]-4,5-dihydro-1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]-L-leucyl- D-a-glutamyl-L-isoleucyl-L-lysyl-D-ornithyl-L-isoleucyl-D- phenylalanyl-L-histidyl-D-a-aspartyl-L-asparagin] (bacitracin Z).

Tạp chất O: 4,10-anhydro[N-[[(4R)-2-((IS,2S)-1-amino-2-methylbutyl]-4,5-dihydro-1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]-L-leucyl- D-a-glutamyl-5-methylen-L-isoleucyl-L-lysyl-D-ornithyl-L- isoleucyl-D-phenylalanyl-L-histidyl-D-a-aspartyl-L-asparagin]

(bacitracin J1).

Tạp chất P: 4,10-anhydro[N-[[(4R)-2-{(15,25)-1-amino-2-methylbutyl]-4,5-dihydro-1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]-L-leucyl- D-a-glutamyl-L-isoleucyl-L-lysyl-D-ornithyl-5-methylen-L- isoleucyl-D-phenylalanyl-L-histidyl-D-a-aspartyl-L-asparagin]

(bacitracin J2).

Tạp chất Q: 4,10-anhydro[N-[[(4R)-2-((IS,2S)-1-amino-2- methylpent-4-en-1-yl]-4,5-dihydro-1,3-thiazol-4-yl]carbonyl]- L-leucyl-D-a-glutamyl-L-isoleucyl-L-lysyl-D-ornithyl-L-isoleucyl-D-phenylalanyl-L-histidyl-D-a-aspartyl-L-asparagin]
(bacitracin J3).

7 Mất khối lượng do làm khô

Không được quá 5,0 % (Phụ lục 9.6).

(1,000 g, 60 °C, phospho pentoxyd, áp suất không quá 0,1 kPa, 3 h).

8 Tro sulfat

Không được quá 1,0 % (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm.

9 Định lượng

Tiến hành định lượng kháng sinh bằng phương pháp vi sinh vật (Phụ lục 13.9). Dùng bacitracin kẽm chuẩn làm chất đối chiếu.

10 Bảo quản

Trong đồ đựng kín, để ở 2 °C đến 8 °C. Nếu chế phẩm vô khuẩn, bảo quản trong đồ đựng kín, vô khuẩn.

11 Loại thuốc

Kháng sinh.

Ghi chú:
1. Tạp chất A            5. Bacitracin B₂      9. Tạp chất L             13. Tạp chất F

2. Tạp chất B           6. Bacitracin B₃     10. Bacitracin A           14. Tạp chất G

3. Tạp chất C          7. Tạp chất M        11. Tạp chất O             15. Tạp chất H

4. Bacitracin B₁       8. Tạp chất N        12. Tạp chất P và Q    16. Tạp chất E
 

Ghi chú:
1. Tạp chất F           2. Tạp chất G              3. Tạp chất H             4. Tạp chất E