Máy xét nghiệm đếm tế bào dòng chảy và biện pháp kiểm soát chất lượng xét nghiệm đếm tế bào dòng chảy

Trường Đại Học Y Hà Nội - Bộ môn Khoa học xét nghiệm

Chủ biên PGS.TS.BS Đặng Thị Ngọc Dung, TS. Nguyễn Trọng Tuệ

Các tác giả tham gia biên soạn

PGS. TS. BS Đặng Thị Ngọc Dung, TS. Nguyễn Trọng Tuệ, TS. BS. Nguyễn Thúy Hương, TS. BS. Nguyễn Thị Thanh Hải

ThS. Đặng Quang Huy, Ths. BSNT. Nguyễn Quỳnh Giao, Ths. BSNT. Vũ Đức Anh, ThS. Trịnh Thị Phương Dung

Ths. BSNT. Lê Văn Toàn, Ths. BSNT. Ngô Diệu Hoa, BSNT. Phạm Thị Hương Trang, Ths. BSNT. Nguyễn Thị Thu Thảo

Ths. BS. Nguyễn Thị Hảo, CKI. Đỗ Thị Hường, CKI. Nguyễn Thúy Hà, ThS. Vũ Thị Bích Hồng

CN. Lê Thanh Thảo, CN. Nguyễn Hữu Hùng

Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng. Những nhóm ứng dụng lớn nhất có thể kể đến như xác định sự biểu hiện của các thụ thể trên bề mặt tế bào trong đếm số lượng tế bào miễn dịch TCD-4, TCD-8,… trong chẩn đoán theo dõi các bệnh suy giảm miễn dịch PIDs, HIV,...Trong bài viết này, Trung Tâm Thuốc Central Pharmacy (trungtamthuoc.com) xin gửi đến bạn đọc thông tin về phương pháp đếm tế bào dòng chảy.

1 Tổng quan 

Phương pháp đếm tế bào dòng chảy là một công nghệ cung cấp phân tích đa tham số nhanh chóng của các vật chất đơn lẻ trong một hỗn hợp dung dịch. Phương pháp này sử dụng laser làm nguồn sáng để tạo ra tín hiệu ánh sáng tán xạ và ánh sáng huỳnh quang được đọc bởi các thiết bị dò tìm như điốt quang hoặc ống nhân quang. Các tín hiệu này được chuyển đổi thành các tín hiệu điện tử được máy tính phân tích và ghi vào tệp dữ liệu định dạng chuẩn. Các quần thể tế bào có thể được phân tích và/hoặc tinh sạch dựa trên các đặc điểm tán xạ ánh sáng hoặc huỳnh quang của chúng. Nhiều loại thuốc thử huỳnh quang được sử dụng trong phép đo tế bào dòng chảy. Chúng bao gồm, kháng thể liên hợp huỳnh quang, thuốc nhuộm liên kết DNA, thuốc nhuộm khả năng tồn tại, thuốc nhuộm chỉ thị ion và protein biểu hiện huỳnh quang. Phương pháp đo tế bào dòng chảy là một công cụ mạnh mẽ có ứng dụng trong miễn dịch học, sinh học phân tử, vi khuẩn học, virus học, sinh học ung thư và giám sát bệnh truyền nhiễm. Nó đã chứng kiến những tiến bộ vượt bậc trong 30 năm qua, cho phép nghiên cứu chi tiết chưa từng có về hệ thống miễn dịch và các lĩnh vực sinh học tế bào khác. 

2 Lịch sử phát triển của phương pháp 

Kể từ khi máy đếm tế bào dòng chảy đầu tiên được lưu hành trên thị trường cách đây hơn 40 năm, lĩnh vực đếm tế bào dòng chảy đã có những bước phát triển nhảy vọt. Máy đo tế bào dòng chảy ở giai đoạn đầu tiên với sự hạn chế chỉ 1-2 thông số phân tích, ngày nay đã cung cấp với hơn 20 thông số cùng với tốc độ phân tích vượt trội với hang nghìn hạt mỗi giây. Nhiều thành tựu khoa học ban đầu đã xây dựng nền tảng của lĩnh vực này ngày nay. 

• Năm 1934, ghi nhận những nỗ lực đầu tiên trong việc thực hiện đếm tế bào dòng chảy trong dung dịch huyền phù của Moldavan. Ông mô tả thiết bị có cấu tạo gồm một kính hiển vi hội tụ vào một ống thủy tinh mao dẫn, ghi lại sự di chuyển của mỗi tế bào bằng một thiết bị quang điện. 
• Công cụ đếm số lượng và phân tích đặc điểm tế bào máu ở dạng huyền phù được thiết kế và nộp bằng sáng chế bởi WalterCoulter năm 1949 (Coulter, 1953). 
• Thiết kế đầu tiên của máy đo lưu lượng hiện đại của Fulwyler (1965), là một trong số những nghiên cứu nổi bật trong giai đoạn đầu tiên. 

Trong những năm 1960-1970, những tiến bộ nhanh chóng của công nghệ tế bào dòng chảy được thực hiện trên cả Hoa Kỳ và châu Âu. 

• Năm 1969, Lou Herzenberg phát minh ra kỹ thuật phân loại tế bào dựa vào việc sử dụng ánh sáng huỳnh quang (đèn argon) và phát triển thiết bị phân loại tế bào dựa trên kích hoạt huỳnh quang (FACS - Fluorescent Activated Cell Sorter). Trong cùng khung thời gian này, Wolfgang Göhde ở Đức đã phát triển một thiết bị đo tế bào dòng chảy dựa trên huỳnh quang (ICP-11), được Partec đưa vào sử dụng vào năm 1968/69, và liên tiếp những thiết bị khác ra đời trong khoảng thời gian này. 
• Tại hội nghị khoa học kỹ thuật Hoa Kỳ năm 1978, tên gọi “Cytophotometry” được thay thế bằng thuật ngữ “Flow cytometry” được phổ cập trọng rãi cho đến ngày nay. 

Trong giai đoạn tiếp theo từ cuối những năm 1970 – 1980, các nhà nghiên cứu y sinh bắt đầu tạo ra các kháng thể đơn dòng của các kháng nguyên bề mặt tế bào và nội bào và gắn nhãn chúng bằng thuốc nhuộm huỳnh quang. Khi số lượng kháng thể và thuốc nhuộm huỳnh quang tăng lên kéo theo sự phát triển của các hệ thống máy phân tích với khả năng đo đồng thời nhiều tín hiệu huỳnh quang cùng lúc. 

• Năm 1990, máy đo lưu lượng tế bào có khả năng đo đồng thời 7 màu huỳnh quang ra đời. 
• Đến năm 2000, con số này đã lên đến 14. Ngày nay, một số máy đo có khả năng mô tả đặc điểm tế bào lên đến 32 thông số. 

3 Nguyên lý của phương pháp 

Đếm tế bào dòng chảy là một kỹ thuật cho phép phân tích nhanh chóng số lượng và đặc điểm của quần thể tế bào dựa trên đặc điểm của các tế bào đơn lẻ. Nguyên lý chính của kỹ thuật này dựa trên sự phân tích sự tán xạ ánh sáng và phát xạ huỳnh quang xảy ra khi có sự kích thích của chùm tia lazer. Sự tán xạ ánh sáng xảy ra do các đặc tính về cấu trúc, hình thái tế bào và mức độ phức tạp của nhân tế bào. Trong khi đó, sự phát huỳnh quang xuất phát từ một đầu dò với cường độ tỷ lệ với số lượng đầu dò liên kết với một tế bào có thể là ở màng tế bào hay các thành phần bên trong tế bào. 

3.1 Nhuộm màu huỳnh quang 

Trên bề mặt hoặc vật chất bên trong các tế bào đích có các kháng nguyên đặc trưng cho từng quần thể tế bào, hoặc đặc trưng cho một đặc tính nào đó của tế bào. Dựa trên mục đích phân tích các kháng thể khác nhau được sử dụng cho việc nhuộm màu. Thông qua việc xác định sự hiện diện các kháng nguyên trên bề mặt/nội bào tế bào này, người ta có thể xác định sự có mặt cũng như số lượng, phần trăm hay các đặc tính khác như tỷ lệ sống chết, mức độ trưởng thành, các tế bào đích tương ứng trong quần thể tế bào phân tích. 

Ví dụ: khi muốn phân tích quần thể tế bào T-CD4 các kháng nguyên đặc trưng được nhắm đến là CD3+ và CD4+, tế bào lympho TCD8: kháng nguyên CD3+ và CD8+, tế bào NK: kháng nguyên CD3- CD16+CD56. 

Thông thường, các kháng thể đơn dòng có gắn chất phát huỳnh quang có khả năng gắn đặc hiệu với các kháng nguyên tế bào, khi được ủ với mẫu phân tích, các kháng thể đơn dòng có gắn chất phát huỳnh quang sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng chúng có trên bề mặt tế bào theo nguyên lý kháng nguyên kháng thể. Dưới sự tác động của ánh sáng từ bộ phận phát tia laser các chất phát huỳnh quang sẽ hấp thụ năng lượng cao từ nguồn sáng sẽ bị kích thích và giải phóng ra ánh sáng huỳnh quang để trở về trạng thái năng lượng thấp hơn. Các ánh sáng huỳnh quang sẽ qua hệ thống kính lọc được thu nhận bởi hệ thống thu nhận tín hiệu quang học của máy tại những kênh thu tín hiệu huỳnh quang (FL) từ đó xác định các đặc điểm cần quan tâm ở tế bào. 

3.2 Thu nhận tín hiệu 

Tín hiệu thu được từ phân tích tế bào dòng chảy là một hệ thống tập hợp các dữ liệu tín hiệu khác nhau bao gồm các tín hiệu trực tiếp từ việc tán xạ ánh sáng, tín hiệu thu được từ sự phát xạ ánh sáng huỳnh quang. 

Với ánh áng tán xạ, ánh sáng tán xạ góc thẳng sẽ được thu nhận qua các kênh FSC (Forward Scatter Chanel), phản ánh kích thước tế bào/vật thể phân tích. Ánh sáng tán xạ góc bên sẽ được thu nhận qua kênh SSC (Side Scatter Chanel), phản ánh độ phức tạp nhân và bào tương của tế bào. Nhìn chung kích thước của tế bào hoặc của một hạt và độ phức tạp bên trong tế bào được đặc trưng bởi mức độ tán xạ. 

3.3 Tín hiệu huỳnh quang 

Các tín hiệu màu huỳnh quang (FL-Fluoressent Light) từ phức hợp kháng thể kháng nguyên trên bề mặt tế bào đích cũng được thu nhận theo các kênh màu huỳnh quang và được khuếch đại trong các ống nhân quang PMTs (photomultipliers tube). Các tín hiệu này được chuyển đổi thành tín hiệu điện tử và biểu thị dưới dạng biểu đồ gồm các quần thể dương tính và âm tính với các kháng nguyên được khảo sát, từ đó đưa ra được những điểm đặc trưng của quần thể phân tích. 

Số lượng kênh màu huỳnh quang và hệ thống tín hiệu thu nhận được thiết kế khác nhau tùy theo từng hệ thống máy sử dụng. Thông thường các hãng khác nhau có đôi chút khác biệt trong việc bố trí đèn huỳnh quang và các hệ thống kính lọc, do vậy các kênh màu huỳnh quang cũng có đôi chút khác biệt. Điều này cần chú ý vì sẽ liên quan đến việc lựa chọn phối hợp màu huỳnh quang trong các phân tích đa màu. 

Tổng hợp các tín hiệu về ánh sáng tán xạ góc thẳng, ánh sáng tán xạ góc bên và các tín hiệu về ánh sáng huỳnh quang tương ứng của một tế bào sẽ giúp chúng ta phân biệt tế bào này với các nhóm tế bào khác trong quần thể. Ngoài ra, việc khoanh vùng (gating) quần thể mong muốn còn giúp thực hiện thống kê hoặc tiếp tục phân tích sâu hơn. 

4 Cấu tạo cơ bản của máy xét nghiệm đếm tế bào dòng chảy

Với lịch sử phát triển hơn 50 năm, trải qua nhiều thế hệ với nhiều cải biến nhằm tối ưu hóa và nâng cao công suất. Nhưng cấu tạo cơ bản của hệ thống không có nhiều thay đổi. Máy đếm tế bào dòng chảy là sự tích hợp của ba cấu phần cơ bản bao gồm: 

• Hệ thống tạo dòng chảy chất lỏng (Fluidic systems) với vai trò định hướng và tạo dòng chảy tế bào đơn độc đi qua điểm chiếu laser. 
• Hệ thống quang học (Optical system) bộ phận tạo và thu thập các tín hiệu được tạo ra bởi tán xạ và phát xạ ánh sáng. Bao gồm hai hệ thống cấu thành: Hệ thống kích thích quang học (Excitation optical system) và hệ thống thu nhận tín hiệu quang (Emission optical system) 
• Hệ thống điện tử (Electronic system) chuyển đổi tín hiệu quang thành tín hiệu số và xử lý phân tích dữ liệu. 

4.1 Hệ thống tạo dòng chảy chất lỏng 

Hệ thống tạo dòng chất lỏng là thành phần căn bản nhất của một máy đếm tế bào dòng chảy. Hệ thống tạo dòng chất lỏng có cấu tạo gồm có 2 vùng chất lỏng với áp lực khác nhau. Dòng chất lỏng bên ngoài (sheath fluid) còn được gọi là dung dịch dòng bao thường là dung dịch muối đệm photphat (PBS) có tác dụng “điều hòa” dòng mẫu chảy qua lõi trung tâm (core fluid) thành một dòng hẹp, các tế bào/hạt vật chất trong mẫu chỉ có thể đi qua khe hẹp đó từng cái một. Tốc độ vận chuyển vật chất qua dòng lõi được điều chỉnh dựa trên sự thay đổi áp lực bơm mẫu. Áp lực dòng lõi luôn lớn hơn áp lực dòng bao và sự thay đổi áp lực dòng bao đảm bảo rằng dòng vận chuyển vật chất luôn là dòng đơn. Tốc độ này được điều chỉnh dựa trên mức độ chênh lệnh áp lực giữa dòng bao và dòng lõi có thể mở rộng hoặc thu hẹp tiết diện dòng lõi, phù hợp với yêu cầu phân tích. Để thực hiện các phép đo định tính như xác định kiểu hình miễn dịch tế bào, tốc độ dòng chảy được đặt ở giá trị cao hơn. Trong khi đó, để phân tích hàm lượng DNA với độ phân giải cao hơn là điều kiện tiên quyết có thể đạt được bằng cách sử dụng tốc độ dòng chảy chậm hơn, trong đó dòng mẫu trở nên hẹp hơn, do đó làm tăng độ chính xác của chiếu sáng. Hoạt động thích hợp của các thành phần chất lỏng là rất quan trọng để đánh chặn chính xác các tế bào bằng chùm tia lazer. Hệ thống chất lỏng phải luôn không có bọt khí và/hoặc các mảnh vụn và phải được duy trì ở áp suất tối ưu. Nhờ cơ chế này hệ thống mới có thể phân tích đồng thời nhiều đặc tính trên từng tế bào một cách chính xác, giảm được yếu tố nhiễu. Dịch dùng tạo dòng thường phải đáp ứng 2 yêu cầu: (1) không gây ảnh hưởng tới tế bào (không làm vỡ tế bào); và (2) không là ảnh hưởng đến độ chiết quang và tín hiệu huỳnh quang của hệ thống ở một số dòng máy người ta sử dụng ống vi mao thay thế cho dòng bao. 

Trong các máy đo có khả năng phân loại tế bào (sorting cell), phân loại theo giọt là hệ thống phân loại phổ biến nhất, trong đó hệ thống chất lỏng phải thiết lập một sự tách rời ổn định khỏi dòng chất lỏng trong các giọt đồng nhất (droplet), các giọt chứa các tế bào quan tâm có thể được tích điện và bị lệch hướng trong điện trường để phân loại. Máy đo tế bào tiên tiến được sử dụng ngày nay có thể tích điện các giọt theo sáu cách khác nhau để tách một quần thể thành sáu quần thể con trong các ống thu thập được định vị thích hợp hoặc một đĩa 96 giếng. Các tế bào không mong muốn, kết tụ trong giọt không tích điện và không bị lệch hướng trong quá trình di chuyển và đi vào trung tâm thùng chứa chất thải. Các tế bào được phân loại trong môi trường vô trùng và sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau. Tốc độ phân loại tế bào có thể đạt được với khoảng 25.000-30.000 tế bào mỗi giây với độ tinh khiết cao từ 80-90% tùy thuộc vào tỷ lệ tế bào mục tiêu. 

4.2 Hệ thống quang học 

Bao gồm nguồn phát tia sáng (thường là các đèn laser hoặc đèn hồ quang), hệ thống các kính lọc để định hình và tập trung chùm tia laser tới các máy dò quang học thích hợp, bộ lọc cho phép chỉ có một dải bước song hẹp, gần với đỉnh phát xạ của thuốc nhuộm huỳnh quang mới có thể đi qua được. Các kênh thu tín hiệu quang học, tính hiệu huỳnh quang (FSC – Forward Scatter Chanel, dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc thẳng; SSC – Side Scatter Chanel, dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc bên, các FL (Fluoressen Light), dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng huỳnh quang từ kênh màu huỳnh quang. Số lượng kênh màu huỳnh quang có thể dao động tùy thuộc vào dòng máy; và mục đích sử dụng. Bên cạnh đó, hệ thống nhân quang (PMT Photo Multiplier Tube), bao gồm các ống nhân quang tương ứng với các kênh màu huỳnh quang có vai trò khuếch đại tín hiệu ánh sáng huỳnh quang. 

Bảng 1. Bước sóng kích thích và phát xạ của các chất gắn nhãn 

Khi một tế bào hay một vật thể đi qua nguồn sáng, ánh sáng của nguồn sáng sẽ tương tác với vật thể sẽ tạo ra các ánh sáng tán xạ (tán xạ góc thẳng và tán xạ góc bên) và nếu tế bào/vật thể đó được nhuộm màu huỳnh quang, dưới kích thích của nguồn sáng, chất màu huỳnh quang đó sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang. Các tia sáng này sẽ đi qua hệ thống kính lọc (đó là các thấu kính chỉ cho phép các tia sáng có bước sóng nhất định đi xuyên qua). Với hệ thống kính lọc này các tia sáng tán xa và ánh sáng huỳnh quang sẽ được phân chia và đi đến hệ thống thu nhận tín hiệu một cách chính xác. 

4.3 Hệ thống điện tử 

Các thiết bị điện tử liên quan đến việc chuyển đổi các photon ánh sáng thành dữ liệu kỹ thuật số có thể giải thích được. Các ống nhân quang của máy đo lưu lượng tế bào (PMT) là chất bán dẫn tạo ra dòng điện dựa trên sự phát hiện ánh sáng. Các PMT sẽ chuyển đổi các photon được phát hiện thành các tín hiệu điện có thể được biểu hiện dưới dạng biểu đồ cột, biểu đồ mật độ hay biểu đồ điểm trên máy tính thông qua các phần mềm chuyển đổi chuyên dụng theo máy. Mỗi tín hiệu do máy đo tế bào phát hiện được gọi là "sự kiện" và tất cả các sự kiện đối với mẫu đã chuẩn bị được máy đo tế bào thu nhận và lưu trữ trên máy tính. Máy tính cũng chịu trách nhiệm điều chỉnh chức năng của lưu lượng kế tế bào. Phân tích đồ họa của các mẫu có thể được giải thích dưới dạng hình ảnh một, hai hoặc ba chiều bằng cách sử dụng phần mềm được thiết kế để phân tích dữ liệu đo lưu lượng tế bào. Phân tích dữ liệu thường được mô tả dưới dạng đồ họa và đi kèm với kết quả xét nghiệm của bệnh nhân. Nó có thể được hiển thị theo nhiều cách khác nhau tùy mục đích của người sử dụng. 

5 Ứng dụng của máy đếm tế bào dòng chảy

Có rất nhiều ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng và trong nghiên cứu được triển khai trên máy đếm tế bào dòng chảy: 

5.1 Phân tích đặc điểm kiểu hình của tế bào máu 

Đây là một ứng dụng phổ biến của phương pháp đếm tế bào dòng chảy, sự xác định kiểu hình miễn dịch hoặc đặc điểm kiểu hình của tế bào là việc xác định và định lượng một nhóm tế bào cụ thể trong quần thể hỗn hợp sử dụng phương pháp đếm tế bào dòng chảy, ví dụ tế bào miễn dịch của máu. Các protein bề mặt tế bào cụ thể, được gọi là chất đánh dấu, có thể được phát hiện bằng cách sử dụng các kháng thể gắn huỳnh quang.Những kháng nguyên cụ thể này có thể được biểu hiện trên nhiều loại tế bào. Do đó, việc định kiểu miễn dịch của các tế bào có thể được thực hiện bằng cách nhuộm đồng thời một tế bào đơn lẻ với hai hoặc nhiều kháng thể. 

5.2 Đo lường các dấu hiệu apoptosis 

Đo lường nhanh chóng và định lượng các tế bào apoptotic có thể được phát hiện bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy. Các phương pháp để phát hiện các tế bào đang trải qua quá trình apoptosis (tế bào chết theo chương trình) được phát triển nhằm phát hiện các đặc tính apoptotic của tế bào một cách nhanh chóng và cho phép chúng giữ trạng thái tự nhiên của chúng để có được độ tin cậy cao nhất các kết quả. Nhiều phương pháp đo tế bào dòng chảy khác nhau cho đánh giá quá trình apoptosis trong tế bào đã được mô tả bao gồm đo lường các thay đổi của màng plasma, phát hiệncủa caspase-3 hoạt động và sự phân mảnh DNA.

5.2.1 Phát hiện những thay đổi của màng sinh chất 

Apoptosis được đặc trưng bởi nhiều loại phân tử và thay đổi hình thái. Một trong những sự kiện sớm nhất trong apoptotic là sự thay đổi trong màng sinh chất. Màng Phosphatidylserine được chuyển vị từ bên trong ra bên ngoài mà không ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của màng, dẫn đến phát hiện đỉnh của quá trình apoptosis do mất tính toàn vẹn của màng sinh chất. Sự gắn nhãn Annexin V và 7-AAD được sử dụng để đánh giá sự thay đổi màng. Annexin V-dương tính, 7-AAD-âm tính tế bào được định nghĩa là tế bào apoptotic giai đoạn sớm với màng tế bào nguyên vẹn với phosphatidylserine được ngoại hóa. Ngược lại, Annexin V-dương tính và 7-AAD-tế bào dương tính được xác định là tế bào chết. 

 Hình A, B biểu diễn quần thể tế bào dương tính với AnnexinV và 7AAD, Hình C, D quần thể tế bào dương tính kép với CD4+ và Annexin V hoặc 7AAD, Hình E: góc phần tư dưới phải biểu thị quần thể tế bào dương tính với Annexin V và âm tính với 7AAD (apoptotic sớm) trong khi góc phần tư trên bên phải biểu thị Annexin V dương tính và 7 AAD dương tính (Appototic muộn). 

5.2.2 Phát hiện hoạt động của capspase-3 đang hoạt động 

Một dấu hiệu khác của quá trình apoptosis là sự kích hoạt của các caspases enzyme không hoạt động ở trạng thái bình thường của tế bào. Trong chết tế bào theo chương trình các enzyme này chuyển dạng hoạt động. Một trong những caspases hiệu ứng đã được kích hoạt ở giai đoạn apoptosis muộn là caspase-3. 

5.2.3 Phát hiện protein ty thể 

Bcl-2 là một proto-oncogene của người nằm trong màng của lưới nội sinh chất, vỏ nhận và ngoài màng ty thể. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng Bcl-2 là protein nội bào quan trọng của quá trình chống apoptosis, mức độ giảm Bcl-2 cho thấy sự tiến triển của apoptosis. Để phát hiện hoạt động của Bcl-2 các tế bào được gắn kháng thể kháng Bcl-2 gắn huỳnh quang và được phân tích bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy. 

Trong hình B, góc phần tư trên bên phải thể hiện quần thể tế bào lympho TCD4 dương tính với Bcl-2 

5.2.4 Phát hiện sự phân mảnh DNA 

Sự chết tế bào theo chương trình đi kèm với sự suy thoái của DNA. Đặc điểm dễ dàng nhất để phát hiện tổn thương DNA là sự xuất hiện của DNA phân mảnh. Sau khi thẩm thấu, đa phần các DNA bị phân mảnh bị rò rỉ ra ngoài tế bào phát hiện sự hiện diện của các mảnh DNA ngoại bào bằng phương pháp đếm thế bào dòng chảy cũng là một trong những chỉ dấu hữu hiệu cho phân tích apoptosis. Các tế bào được nhuộm bằng propidium iodide (PI), phần tích các đặc điểm DNA đại diện cho các phase của tế bào G0/G1, S và G2/M, quần thể các tế bào apoptosis được đại diện bởi một quần thể G0/G1 con nằm bên trái của đỉnh G0/G1 (Hình 12). 

5.2.5 Phân tích chu kỳ ADN/tế bào

Phân tích chu kỳ tế bào mà một trong những ứng dụng cơ bản của đếm tế bào dòng chảy. Lượng DNA trong tế bào là thông số duy nhất được sử dụng cho quá trình phân tích như vậy. Các tế bào phát triển theo cấp số nhân và trải qua một loạt những thay đổi trong quá trình tiến triển của chu kỳ tế bào. Các phép đo DNA cho phép phân chia quần thể tế bào thành 3 giai đoạn cơ bản của chu kỳ tế bào: G0/G1, S và G2+M. Tế bào bình thường không phân chia (G0/G1) chứa DNA lưỡng bội (2n), trong giai đoạn tổng hợp S, sự nhân đôi DNA xảy ra. Do đó, trong pha S và pha M hàm lượng DNA của các tế bào cao gấp 2 lần so với các tế bào ở pha G0/G1. Các quần thể tế bào có tỷ lệ thấp G0/G1, được xác định là tế bào apoptotic vì sự suy thoái rộng rãi của DNA là một dấu hiệu của quá trình apoptosis như đã được trình bày ở phần trên. Các phân tích chu kỳ tế bào được thực hiện bằng cách sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết theo phương pháp phân tích với DNA. Một số thuốc nhuộm thể hiện liên kết xen kẽ (ví dụ, propidium iodide (PI)) trong khi những thuốc nhuộm khác thể hiện ái lực với các vùng giàu DNA AT (ví dụ, Hoechst 33342 và DAPI) hoặc các vùng giàu GC (ví dụ, mithramycin) thuốc nhuộm như vậy có ái lực với cả DNA và RNA, nên cần phải xử lý RNAse để định lượng DNA trong quá trình phân tích chu kỳ tế bào. Tế bào phải được cố định trước khi nhuộm DNA. Formaldehyde, khi được sử dụng như một chất cố định, liên kết chéo với chất nhiễm sắc và làm giảm khả năng liên kết của thuốc nhuộm. Do đó, chất cố định khử nước như Ethanol thường được sử dụng để tạo sự ổn định trong quá trình bảo quản lâu dài. Sau khi cố định và nhuộm, khi mẫu được phân tích bằng FCM, tổng phát xạ huỳnh quang từ tế bào được coi là tương đương với hàm lượng DNA của tế bào. Đối với phân tích chu kỳ tế bào, các mẫu phải được phân tích ở tốc độ dòng chảy chậm hơn (< 1000 tế bào mỗi giây) để đạt được sự phân biệt tốt giữa các mẫu đơn và mẫu kép. Tốc độ dòng chảy chậm như vậy cung cấp độ phân giải cao hơn mong muốn cho phân tích hàm lượng DNA vì chúng làm giảm kích thước của dòng mẫu và tăng tính đồng nhất và độ chính xác của sự chiếu sáng. 

Xác định các giai đoạn của chu trình phân bào, khảo sát sự bất thường trong bộ nhiễm sắc thể, xác định tổn thương ADN, nghiên cứu tác dụng của thuốc kháng ung thư lên trên tế bào đích... 

5.2.6 Phân tích túi ngoại bào (Extracellular vesicles-EV) 

Các tế bào giải phóng các túi ngoại bào (EV) có kích thước 0,1–1 um vào môi trường ngoại bào để phản ứng với sự hoạt hóa hoặc quá trình chết rụng hoặc nhiễm virus. EV có thể hoạt động như phương tiện giao tiếp giữa các tế bào. Vai trò của chúng vừa là chất chỉ điểm vừa là tác nhẫn gây bệnh trong các tình trạng bệnh khác nhau như ung thư đã làm tăng sự quan tâm đến việc phát hiện chúng trong thực hành lâm sàng. Các phân tử sinh học cụ thể được kết hợp một cách có chọn lọc vào các EV trước khi giải phóng chúng ra môi trường ngoại bào. Để đo EV bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy, một số chiến lược khác nhau có thể được sử dụng trong đó hai cách tiếp cận phổ biến nhất là các EV được lựa chọn theo kích thước của chúng sau đó cường độ huỳnh quang chỉ được phân tích theo các quần thể đã chọn trước đó, với chiến lược thứ 2 các EV được chọn trước trên cơ sở ngưỡng dựa trên tín hiệu huỳnh quang và sau đó các quần thể cụ thể được xác định bằng cách định vị dựa trên phân tán. EV có thể được phân lập từ môi trường nuôi cấy tế bào hoặc từ dịch cơ thể như máu, nước tiểu... Các quần thể EV có thể phát hiện được sau khi ủ môi trường/dịch cơ thể được điều hòa như vậy với các kháng thể đơn dòng được đánh dấu fluorochrome chống lại các kháng nguyên cụ thể được biểu hiện bởi các EV đó (phụ thuộc vào loại tế bào mà từ đó các EV đó được tạo ra). 

Ngoài ra, kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy còn được ứng dụng trong nghiên cứu biến dưỡng tế bào, hoạt động cá kênh ion, các cơ quan nội bào, pH nội bào, ảnh hưởng của thuốc lên trên sinh lý tế bào... 

6 Quy trình vận hành thiết bị

6.1 Thẩm định và xác nhận giá trị sử dụng phương pháp 

Cũng như các hệ thống máy xét nghiệm khác, trước khi đưa vào vận hành sử dụng máy đếm tế bào dòng chảy, phòng xét nghiệm cần phải đảm bảo rằng phương pháp xét nghiệm đó phải chứng minh được rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu để đảm bảo tính tin cậy của kết quả xét nghiệm thông qua việc thực hiện các thực nghiệm thẩm định và xác nhận phương pháp. Việc thực hiện các thực nghiệm cụ thể được căn cứ dựa trên mục đích sử dụng máy xét nghiệm đếm tế bào dòng chảy của phòng xét nghiệm đó cho mục đích định lượng hay bán định lượng. 6.2. Quy trình thực hiện xét nghiệm 

6.1.1 Kiểm soát chất lượng (Quality control-QC) 

Đếm tế bào dòng chảy là một kỹ thuật nhạy cảm và có thể thay đổi cao, có thể được sử dụng trong cả nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng. Thực hiện quy trình kiểm soát chất lượng (QC) là một chiến lược để đảm bảo rằng dữ liệu đo tế bào dòng chảy là đáng tin cậy, nhất quán và có thể đáp ứng các tiêu chuẩn cần thiết cho các yêu cầu quy định hoặc thử nghiệm lâm sàng. QC của các giao thức đếm tế bào dòng chảy liên quan đến tất cả các khía cạnh của thí nghiệm, bao gồm cả máy đo lưu lượng tế bào, thuốc thử, phương pháp và mẫu. Các quy trình QC này kiểm tra sự phù hợp của tín hiệu quang học, độ nhạy và độ tuyến tính của máy dò và mức bù tín hiệu. Các phép đo QC hàng ngày đảm bảo rằng thiết bị nằm trong phạm vi tiêu chuẩn xác định trước cho tất cả các thông số được yêu cầu. Tần suất thực hiện và loại mẫu QC được sử dụng phụ thuộc vào loại xét nghiệm mà phòng xét nghiệm đang áp dụng, tần suất thực hiện các xét nghiệm và mức độ ổn định của các kết quả từ hệ thống. 

6.1.2 Bù tín hiệu (compensation) 

Trong phép đo tế bào dòng chảy, hiện tượng chồng lấp tín hiệu huỳnh quang có lẽ là một trong những vấn đề lớn nhất đối với nhà khoa học và là nguyên nhân của dữ liệu xấu. Việc bù đắp chính xác cho hiện tượng chồng lấp này là rất quan trọng để xác định chính xác các quần thể trong các thí nghiệm về dòng chảy với nhiều kênh màu được sử dụng. Sai số trong việc bù đắp có thể dẫn đến các quần thể dương tính giả hoặc sai số về tỷ lệ phần trăm quần thể do định vị sai. 

Các chất phát xạ huỳnh quang cho thấy phổ phát xạ rộng. Ví dụ, mặc dù FITC phát huỳnh quang chủ yếu bằng màu xanh lá cây, nhưng nó phát ra trên một phổ các bước sóng phát xạ chứa một dải màu từ xanh lục đến đỏ. Đối với nhiều chất phát xạ huỳnh quang thường được sử dụng, mặc dù bước sóng phát xạ cực đại là khác nhau đối với mọi chất phát xạ này, phổ phát xạ thường có sự trùng lặp giữa chúng. 

Một phần huỳnh quang do FITC phát ra được truyền qua bộ lọc PE và được phát hiện trong kênh PE. Đây được gọi là sự chồng chéo quang phổ. Sự lan truyền của tín hiệu FITC vào bộ dò kênh PE dẫn đến sự xuất hiện của một quần thể dương tính với PE. Sự chồng chéo phổ được bù bằng cách trừ đi một phần của tín hiệu FITC từ tổng tín hiệu PE. 

Để thiết lập mức bù, điện áp trên các ống nhân quang trên tất cả các kênh huỳnh quang đang sử dụng được đặt để đạt được sự phân tách rõ ràng giữa các quần thể tế bào âm và dương. Sau đó, các tế bào được gắn nhãn huỳnh quang đơn lẻ được phân tích và áp dụng sự bù trừ bằng cách trừ đi phần của một tín hiệu huỳnh quang cho một tín hiệu huỳnh quang khác. Đối với hai hoặc ba chất phát xạ huỳnh quang phương pháp bù thủ công như vậy là phù hợp; với bốn màu trở lên, phòng xét nghiệm nên sử dụng phương pháp tự động. Trong các máy hiện đại, phần mềm được sử dụng để tính toán phần bù được áp dụng sau khi phân tích mẫu. 

7 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích và biện pháp khắc phục

Các xét nghiệm đếm tế bào dòng chảy tạo ra dữ liệu tương đối và chúng phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện thực hiện thí nghiệm (ví dụ: chất lượng mấu, chất lượng thuốc thử, mức độ thuần thục của người thực hiện hay hiệu suất của thiết bị). Để đạt được mức độ ổn định và chính xác của kết quả theo thời gian, mỗi bước đơn lẻ trong quy trình thực hiện tổng thể của xét nghiệm đếm tế bào dòng chảy cần phải được kiểm soát. Trong khuôn khổ nội dung của bài, chúng tối tập trung vào khía cạnh thiết bị và thẻo luận các nội dung quan trọng trong việc duy trì sự ổn định của thiết bị để đảm bảo mức chất lượng không thay đổi của xét nghiệm. 

Các tín hiệu được tạo ra bởi các thiết bị đo tế bào dòng chảy được xác định bởi nhiều yếu tố khác nhau, chẳng hạn như bố trí quang học (công suất laser và laser, bộ lọc quang học), chất lỏng dòng bao, khí hậu trong phòng... Do đó, điều kiện tiên quyết là phải “năm được” hiệu suất của hệ thống tương ứng tại một thời điểm nhất định. Bằng cách sử dụng các kiểm soát và tiêu chuẩn thích hợp, có thể xác định trạng thái ban đầu của hiệu suất thiết bị và theo dõi nó theo thời gian. Điều này có thể được thực hiện theo nhiều cách khác nhau và phụ thuộc vào loại thiết bị (máy phân tích, máy phân loại tế bào), cách bố trí thiết bị (số lượng tia laser, hệ thống thông lượng cao (HTS)) và loại phép đo mà người ta muốn tiến hành (ví dụ: sàng lọc, các xét nghiệm chẩn đoán, định tính so với định lượng hoặc thể tích). Do sự đa dạng ngày càng tăng của các máy đo lưu lượng hiện có trên thị trường, không có quy trình chung nào về việc tiến hành bảo dưỡng và khung thời gian cũng như khoảng thời gian bảo trì có thể khác nhau giữa các loại thiết bị này với loại thiết bị khác. Lưu ý rằng đối với một số bước trong quá trình bảo trì (ví dụ: căn chỉnh tia laser) các biện pháp phòng ngừa bổ sung (ví dụ: đeo kính bảo hộ laser) là cần thiết để thích ứng với khả năng nguy hiểm bị thay đổi (quang học (laser năng lượng cao), sinh học hoặc điện (điện áp cao)) so với hoạt động của thiết bị thông thường. Những can thiệp đó chỉ nên được thực hiện bởi các kỹ sư dịch vụ hoặc người sử dụng được đào tạo đặc biệt với các thiết bị bảo vệ cá nhân và đánh giá rủi ro cần thiết tại. 

7.1 Bảo trì các thiết bị quang học 

Bảo dưỡng bắt đầu bằng việc làm sạch thiết bị. Để tránh nguy hiểm do bức xạ laser hoặc các nguy cơ về điện, thực hiện công việc này mà không cần bật máy đo tế bào. Ví dụ, cần phải loại bỏ bụi khỏi hệ thống thông gió để cho phép làm mát không khí hiệu quả, đảm bào các tia laser và nguồn cung cấp điện cũng như từ các bộ lọc quang học (BP, SP và LP), gương (lưỡng sắc) và lăng kính của đường quang. Bụi sẽ làm giảm sự liên kết và độ nhạy của tia laser của tín hiệu huỳnh quang bằng cách tạo ra tín hiệu nền bổ sung và làm mất tín hiệu huỳnh quang. Các bộ phận này có thể được làm sạch bằng không khí điều áp không bị bám cặn (ví dụ, như được sử dụng cho các bộ phận điện tử hoặc máy tính) và có thể loại bỏ bụi bền hơn bằng bông ngoáy tai hoặc khăn lau giấy không có bụi (làm ẩm bằng một giọt metanol nguyên chất, metanol sẽ bay hơi mà không để lại cặn trên quang học)... Nhiều tia laser của máy đo dòng tế bào được dẫn hướng qua các hệ thống lăng kính đến vị trí phát hiện và do đó, tương đối ổn định theo thời gian trong sự liên kết của chúng. Các máy khác được trang bị chuỗi thấu kính quang học cố định, làm cho việc căn chỉnh bộ lọc và laser lặp đi lặp lại gần như lỗi thời. Nhưng trong mọi trường hợp, điều quan trọng là phải kiểm tra (hoặc “biết”) tình trạng thiết bị trước khi đo. Mức độ thường xuyên của các loại bảo trì phòng ngừa này phải được thực hiện nghiêm ngặt tùy thuộc vào điều kiện môi trường và đôi khi được bao gồm trong hợp đồng bảo trì của các nhà cung cấp. 

7.2 Hệ thống tạo dòng chảy chất lỏng 

Hệ thống chất lỏng của hầu hết các máy đo tế bào dòng chảy cần được bảo trì thường xuyên. Người ta phải đảm bảo rằng các dòng chất lỏng và bộ lọc không có bọt khí. Không khí bị có thể gây ra tín hiệu huỳnh quang “nhảy múa” không ổn định do tính toán thời gian không chính xác của các tín hiệu đến, không khí trong hệ thống sẽ gây ra giá trị sai cho việc đếm thể tích tế bào hoặc sẽ dẫn đến các tập tín hiệu ánh sáng thẳng (FSC) trống mà không có bất kỳ sự kiện đo nào. Máy càng có nhiều tia laser thì hệ thống chống lại bọt khí hoặc nguồn cung cấp khí nén không ổn định càng kém. Do đó, vỏ bọc hoặc bộ lọc dung dịch dòng bao phải được xử lý “đuổi khí” hàng ngày và thay thế 6 tháng một lần (khoảng thời gian thường được các nhà sản xuất đề xuất). 

Bể chứa dung dịch dòng bao phải được đảm bảo về mặt thể tích và kiểm tra mức độ rò rỉ thường xuyên. Khi xảy ra các vấn đề với bể chứa này, hậu quả tương tự như mô tả ở trên đối với bọt khí bị cuốn vào. Một hệ quả khác trong máy phân loại tế bào là sự không ổn định trong sự lưu thông của dòng lõi, phụ thuộc rất nhiều vào sự ổn định của áp suất dòng bao. Một số máy cung cấp các giao thức khởi động và tắt máy bán tự động, cũng như các quy trình làm sạch mà chúng có thể chạy sau một khoảng thời gian xác định hoặc theo yêu cầu. Nói chung, có ít nhất bốn quy trình cơ bản để duy trì một hệ thống chất lỏng, tùy thuộc vào mục đích làm sạch: khử trùng/khử nhiễm, tránh kết tinh để bảo quản lâu dài (ví dụ: qua đêm), mở khóa và tẩy trắng (loại bỏ thuốc nhuộm nhiễm chéo). 

7.3 Dòng lõi 

Để lưu trữ lâu dài, chẳng hạn như để máy qua đêm hoặc trước khi bảo trì thông qua kỹ sư dịch vụ, hầu hết các phòng thí nghiệm chạy một quy trình khử nhiễm, sau đó là chu kỳ rửa trước khi tắt thiết bị (hoặc giao nó cho kỹ sư). Các giải pháp được sử dụng phổ biến nhất để khử nhiễm một máy đo lưu lượng là natri hypoclorit 1% hoặc 70-80% Ethanol. Nhưng cũng có thể sử dụng Hydrogen peroxide 1% mới chuẩn bị. Nước cất hoặc nước khử ion là lý tưởng để rửa sạch dung dịch tẩy rửa. Để giữ máy ở trạng thái “ngủ”/không sử dụng trong thời gian dài hơn (tuần/tháng), người ta có thể làm khô các bồn chứa và đường ống hệ thống hoàn toàn sau quá trình làm sạch hoặc xả tất cả các đường và bồn chứa bằng nước cất hoặc nước khử ion (chứa một số chất bảo quản để ngăn ngừa nhiễm vi khuẩn và nấm). Khi có thể, một ống mẫu chứa nước cất có thể được để lại tại kim hút mẫu. Tất cả điều này là để đảm bảo rằng không có sự hình thành tinh thể muối nào xảy ra, sau đó có thể gây tắc nghẽn, ngay cả khi kim hút hoặc đường ống bị khô. 

Các tế bào dính hoặc vón cục, không được lọc đúng cách hoặc sử dụng ở nồng độ tế bào quá cao, có thể làm tắc lỗ thoát khí của một thiết bị. Trong một số thiết bị, người ta có thể đảo ngược hướng của chất lỏng để đẩy vật tắc nghẽn ngược ra khỏi đường ống. Trong các máy mà người ta có thể dễ dàng tiếp cận và tháo kim hút, phương án cuối cùng, người ta có thể sử dụng dây mỏng để làm sạch kim hút, hoạt động giống như một người quét dọn ống khói. 

Việc sử dụng nhiều thuốc nhuộm huỳnh quang cho các mục đích phân tích khác nhau trong một lần xét nghiệm cũng có thể gây ảnh hưởng tới quá trình đo. Những loại thuốc nhuộm này thường được nhuộm quá nhiều để đảm bảo màu sắc đẹp. Do cấu trúc phẳng, chúng dính và cũng có thể dính vào đường ống. Do đó, có khả năng cao xảy ra các mẫu nhiễm chéo giữa những người sử dụng khác nhau. Cho dung dịch tẩy trắng (ví dụ: natri hypoclorit 1%) trong 5–10 phút sẽ ngăn ngừa được điều này. Để kiểm tra việc làm sạch hiệu quả, chạy mẫu tế bào không nhuộm màu và quan sát trong biểu đồ lưỡng biến (kênh huỳnh quang của thuốc nhuộm (ví dụ: PI) so với thời gian) nếu nền của các tế bào này tăng lên theo thời gian. Trong trường hợp đó, làm sạch bổ sung là cần thiết. Trong tất cả các tình huống, người ta phải cẩn thận với việc sử dụng các dung dịch ăn mòn/xâm thực và đảm bảo rằng chúng được rửa sạch/thay thế bằng chất lỏng vỏ bọc hoặc nước cất tương ứng và không bị để lại bên trong tế bào dòng chảy trong một thời gian dài, vì điều này có thể làm hỏng đường ống và tắc nghẽn và dẫn đến hệ thống bị rò rỉ. 

7.4 Máy tính và phần mềm 

Bên cạnh các bước bảo trì được mô tả ở trên để đảm bảo chức năng thích hợp của máy, máy tính và phần mềm cần phải chú ý một số vấn đề. Việc chống phân mảnh ổ cứng của máy tính và sao lưu các tệp dữ liệu nên được lên lịch thường xuyên (hàng tuần/hàng tháng, tùy thuộc vào mức độ sử dụng). Khi các tệp dữ liệu được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu, người ta nên lưu ý rằng kích thước của cơ sở dữ liệu không vượt quá giới hạn kích thước được khuyến nghị. Điều này sẽ làm suy yếu và làm chậm hiệu suất của toàn bộ hệ thống tại một thời điểm nhất định. 

8 Kết luận 

Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy bắt nguồn từ những năm 1960 là một kỹ thuật thiết yếu và được sử dụng rộng rãi cho một số ứng dụng trong nghiên cứu sinh học và chẩn đoán lâm sàng cho đến tận ngày nay. Khả năng phát hiện nhanh chóng nhiều thông số trong các tế bào đơn lẻ và sắp xếp và thậm chí tách các dòng tế bào theo các đặc tính mong muốn phù hợp với mục đích nghiên cứu chúng đã tạo ra một cuộc cách mạng trong việc nghiên cứu các quần thể tế bào không đồng nhất cũng như hiếm. Các công nghệ và ứng dụng đếm tế bào dòng chảy tiên tiến tiếp tục được phát triển để giải quyết những hạn chế của kỹ thuật hiện tại. Việc nắm vững được cấu trúc, cách thức vận hành và cập nhật những kiến thức mới về phương pháp xét nghiệm này sẽ đem lại nhiều giá trị lớn trong lĩnh vực xét nghiệm y học nó riêng và y học tổng thể nói chung trong cả thực hành lâm sàng và nghiên cứu hiện tại và trong tương lai. 

9 Tài liệu tham khảo 

1. Bishop, M. L., Fody, E. P., & Schoeff, L. E. (2018). Clinical chemistry: principles, techniques, and correlations. Eighth edition. Philadelphia: Wolters Kluwer. 

2. Carl A. Burtis & David E.Bruns. (2015). Clinical chemistry and molecular diagnostics 

3. Nader Rifal; Andrea Rita Horvath (2018). Clinical chemistry and molecular diagnostics. Sixth Edition. Elsevier.

4.  PGS. TS. BS. Đặng Thị Ngọc Dung, TS. Nguyễn Trọng Tuệ (2023). “Phương pháp đếm tế bào dòng chảy”. Kỹ thuật và thiết bị xét nghiệm y học. Nhà xuất bản y học, trang 281 - 300. Tải bản pdf tại đây.