Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng: Nguyên tắc và ứng dụng

Trường Đại học Dược Hà Nội

Chủ biên PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

Các tác giả tham gia biên soạn

PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà

TS. Tạ Mạnh Hùng

Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách đơn giản, linh hoạt và tiết kiệm chi phí cho cả phân tích định tính và định lượng, cho phép phân tích đồng thời nhiều chất với yêu cầu thời gian tối thiểu. Trong bài viết này, Trung Tâm Thuốc Central Pharmacy (trungtamthuoc.com) xin gửi đến bạn đọc khái niệm và ứng dụng của sắc ký lớp mỏng.

1 Sắc ký lớp mỏng là gì?

1.1 Nguyên tắc 

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography: TLC) là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ qui định, di chuyển trên bản mỏng dưới tác động của lực mao quản. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả thu được là một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi pha động. 

TLC là một kỹ thuật tách đơn giản, linh hoạt và tiết kiệm chi phí cho cả phân tích định tính và định lượng, cho phép phân tích đồng thời nhiều chất với yêu cầu thời gian tối thiểu. TLC có thể được thực hiện thủ công theo những cách dễ dàng và không tốn kém. Do đó, nó được ứng dụng tại hầu hết các phòng thí nghiệm như một công cụ thuận tiện để phân tách đơn giản và nhanh chóng. Khi các kỳ vọng ngày càng tăng liên quan đến chất lượng và giá trị của một phép phân tích, sẽ yêu cầu các công cụ phù hợp cho tất cả các bước của TLC. Một bộ thiết bị TLC có thể chỉ đơn giản, với kinh phí nhỏ, bao gồm một bình đáy phẳng, kín, kích thước phù hợp; mao quản chấm sắc ký; bản mỏng tráng sẵn; bình phun thuốc thử và đèn huỳnh quang UV 254 nm. 

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin Layer Chromatography: HPTLC) là dạng TLC tiên tiến nhất và bắt nguồn từ việc sử dụng pha tĩnh có hiệu quả phân tách tối đa và thiết bị đo đạc hiện đại cho tất cả các bước trong qui trình: Chẩm mẫu chính xác, chuẩn hóa triển khai sắc ký có thể đạt độ tái lặp cao và đánh giá kết quả bằng phần mềm. HPTLC là toàn bộ khái niệm bao gồm một phương pháp luận được tiêu chuẩn hóa rộng rãi dựa trên các dữ kiện khoa học cũng như việc sử dụng các phương pháp đã được kiểm chứng để phân tích định tính và định lượng. HPTLC đáp ứng tất cả các yêu cầu chất lượng của các phòng thí nghiệm phân tích ngày nay. Hình 3.1, trình bày hệ thống HPTLC của hãng Camag - Thụy Sỹ. 

 - Pha tĩnh và bản mỏng: Pha tĩnh TLC là các hạt có kích thước khoảng 10 - 12 um, độ đồng nhất kém, bề dày lớp pha tĩnh trên bản mỏng khoảng 250 km. Đối với HPTLC, có 2 loại là sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với tiểu phân (hạt) pha tĩnh kích thước hạt khoảng 5 km, độ đồng đều cao, bề dày khoảng 200 km hoặc sắc ký lớp mỏng siêu hiệu năng cao (Ultra Thin Layer Chromatography: UTLC) với lớp chất hấp phụ nguyên khối có hạt cỡ 1 - 2 um, bề dày khoảng 10 km. Bảng 3.1 trình bày so sánh đặc tính hạt pha tĩnh silica gel của Merck loại HPTLC, UTLC với TLC và hình dạng hạt pha tĩnh được minh họa ở Hình 3.2.

- Bộ phận đưa mẫu phân tích lên bản mỏng: Thiết bị phun mẫu bán tự động hoặc tự động hoàn toàn với thể tích chính xác được sử dụng để đưa mẫu lên bản mỏng, đồng thời thiết bị có đường dẫn khí nitơ tạo luồng khí thổi khô dung môi và giảm thiểu khả nặng oxy hóa của chất phân tích trong mẫu trên bản mỏng. Mẫu thử có thể phun dạng điểm, vạch hẹp với kích cỡ xác định tùy chế độ sử dụng. Các mẫu được phun lên tấm bản mỏng sắc ký với thể tích theo lựa chọn, thiết bị cho phép phun các thể tích mẫu lớn hơn so với kỹ thuật chấm mẫu tiếp xúc. Trong khi dung môi pha mẫu được bay hơi gần như hoàn toàn trong quá trình phun mẫu, mẫu được làm giàu trên bề mặt bản mỏng trong các vạch hẹp có chiều dài được xác định trước, Ngay cả khi mẫu được hòa tan trong các dung mỗi phân cực như methanol hoặc nước vẫn có thể được các vùng vạch gọn và hẹp. 

- Bộ phận triển khai sắc ký: Buồng khai triển hoàn toàn tự động, phù hợp cho các kích cỡ bản mỏng phân tích. Buồng khai triển được kết nối với bộ kiểm soát độ ẩm (bộ phận có dòng không khí có độ ẩm xác định được tạo bởi dung dịch muối bão hòa) để tối ưu điều kiện sắc kỹ. Bản mỏng đã chấm mẫu thử được bão hòa, khai triển và lấy khỏi dung môi theo chương trình cài đặt, Kết quả cho độ lặp lại cao, an toàn và thuận tiện. 

- Bộ phận phát hiện và xử lý số liệu: 

+ Thiết bị chụp ảnh và tài liệu hóa sắc ký bản mỏng: Đánh giá kết quả dựa vào quan sát bản mỏng dưới ánh sáng trắng và ánh sáng đèn UV ở bước sóng 254 nm và 366 nm. Thiết bị có máy ảnh số chuyên dụng độ phân giải màu cao với độ chính xác màu sắc tối ưu cho mỗi loại nguồn sáng. Chụp và lưu giữ các sắc đồ. 

+ Đo mật độ vết: Kích cỡ (chiều dài và chiều rộng) vết ứng với chất phân tích trên sắc đồ được đo tại bước sóng lựa chọn. Dải quang phổ nằm trong vùng UV - Vis 190 - 900 nm. Ánh sáng phản xạ được đo ở chế độ hấp thụ hoặc huỳnh quang. Nên đo các mẫu ở dạng dải hẹp và đánh giá mật độ bằng cách quét theo từng phần, tức là quét với một khe khoảng 2/3 chiều rộng của vết (track) sẽ cải thiện độ tái lập vì phần trung tâm của vùng mẫu là đồng nhất. Khi định lượng nên đo ở bước sóng có độ hấp thụ cực đại để tăng độ nhạy của phép thử. 

+ Thiết bị quét (Scanner): Quét phổ của vết chất phân tích trên sắc đồ thu được phổ hấp thụ biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và bước sóng, cũng có thể so sánh với phổ chuẩn để tăng độ tin cậy trong định tính. Đo đáp ứng của vết chất phân tích trên sắc ký đồ tại bước sóng lựa chọn (thường là bước sóng cực đại) để định lượng. Việc định lượng các chất dựa vào chiều cao píc hoặc diện tích píc so với chuẩn theo phương pháp so sánh điểm hoặc đường chuẩn thông qua hồi quy tuyến tính hoặc hồi qui đa thức. 

+ HPTLC - MS: Sử dụng đầu rửa giải với bộ lọc thích hợp để tách vết mẫu và loại hạt pha tĩnh trước khi đưa vào bộ phận khối phổ. Vết chất phân tích được rửa giải từ bản mỏng với methanol hoặc dung môi thích hợp với tốc độ dòng chảy tương thích với hệ thống TLC - MS. Đầu rửa giải tròn được sử dụng cho các vết hình tròn, còn đầu rửa giải hình bầu dục cho vết dạng dải. Sau khi rửa giải, dịch rửa giải được chuyển trực tiếp đến khối phổ kế. Kết quả phân tích HPTLC - MS cho phép định tính nhanh chóng và tin cậy, định lượng độ nhạy cao. 

1.2 Cơ chế tách đối với pha tĩnh silica gel 

Trong TLC, nhiều loại pha tĩnh được sử dụng như silica gel, nhôm oxyd, celulose, C8, C18, cyano, amino, ... tương tự HPLC. Dung môi pha động được lựa chọn dựa vào bản chất của chất phân tích và pha tĩnh. Dung môi khai triển phải không phản ứng hóa học với các chất trong mẫu thử. Cần tránh các dung môi gây ung thư hoặc nguy hiểm cho môi trường. Hệ dung môi bao gồm từ dung môi không phân cực đến phân cực. Dung môi không phân cực thường được sử dụng, vì dung môi phân cực cao gây ra sự hấp phụ với các thành phần khác của hỗn hợp dung môi. Các dung môi thường dùng trong TLC là ether dầu hỏa, n hexan, carbon tetraclorid, pyridin, diethyl ether, formamid, methanol, ethanol, aceton và n - propanol,... Pha tĩnh silica gel được sử dụng phổ biến nhất, khoảng 80% phép phân tích TLC sử dụng loại pha tĩnh này. 

Trong TLC, khi pha động di chuyển qua bề mặt của silica gel, nó sẽ vận chuyển chất phân tích đi qua các phần tử của pha tĩnh. Tuy nhiên, các phân tử chất phân tích chỉ tự do di chuyển cùng dung môi nếu chúng không bị liên kết với bề mặt của silica gel. Do đó, thời gian chất phân tích liên kết với bề mặt của silica gel so với thời gian ở trong dung dịch sẽ quyết định giá trị hệ số lưu giữ của chất phân tích. Khả năng chất phân tích liên kết với bề mặt của silica gel khi có mặt của một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thể có thể được xem như tổng của hai tương tác cạnh tranh. Đầu tiên, các nhóm phân cực trong dung môi có thể cạnh tranh với chất phân tích để tìm các vị trí liên kết trên bề mặt của silica gel. Do đó, nếu sử dụng dung môi có độ phân cực cao, dung môi sẽ tương tác mạnh với bề mặt của silica gel và sẽ để lại ít vị trí tự do trên pha tĩnh để chất phân tích liên kết nên chất phân tích sẽ di chuyển nhanh trên pha tĩnh. Đồng thời, các nhóm phân cực trong dung môi có thể tương tác mạnh với nhóm chức phân cực của chất phân tích và ngăn cản sự tương tác của chất phân tích với bề mặt của silica gel. Hiệu ứng này cũng dẫn đến chất phân tích di chuyển nhanh trên pha tĩnh. Độ phân cực của dung môi được sử dụng cho sắc ký có thể được đánh giá bằng hằng số điện môi, mô men lưỡng cực của dung môi. Hai giá trị này càng lớn thì dung môi càng phân cực. Ngoài ra, khả năng liên kết hydro của dung môi cũng phải được xem xét. 

Tách các hợp chất bằng bản mỏng silica gel dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để liên kết các vị trí trên pha tĩnh phân cực. Cho hai hợp chất khác nhau về độ phân cực lên bản mỏng, hợp chất càng phân cực sẽ tương tác mạnh hơn với silica và sẽ làm giảm khả năng liên kết của pha động với pha tĩnh. Do đó, hợp chất ít phân cực hơn di chuyển lên cao hơn trên bản mỏng và sẽ có giá trị R_f cao hơn. Nếu thay đổi thành phần dung môi pha động hoặc hỗn hợp dung môi phân cực hơn, khả năng đẩy chất tan ra khỏi các vị trí liên kết với silica tăng lên và tất cả các hợp chất trên bản mỏng sẽ di chuyển lên cao hơn trên bản mỏng. Ví dụ, nếu pha động là hỗn hợp ethyl acetat và heptan thì khi tăng tỷ lệ ethyl acetat sẽ cho giá trị R_f cao hơn cho tất cả các hợp chất tách trên bản mỏng. Việc thay của pha động thường sẽ không dẫn đến việc đảo ngược thứ tự rửa giải của các hợp chất trên bản mỏng sắc ký. Tốc độ di chuyển của các chất phụ thuộc vào tính chất vật lý của chúng tức là phụ thuộc vào cấu trúc phân tử, đặc biệt là nhóm chức của chúng và tuân theo quy tắc độ tan “Giống nhau Hòa tan nhau” (Like Dissolves Like). Các chất có tính chất vật lý càng giống với pha động thì nó sẽ ở trong pha động càng lâu tức là di chuyển nhanh cùng pha động, còn các hợp chất ít hòa tan trong pha động và có ái lực cao hơn với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm thậm chí không di chuyển mà vẫn ở tại vị trí ban đầu. 

2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký

Độ phân giải khi tách bằng TLC phụ thuộc vào một số yếu tố bao gồm loại pha tĩnh, thành phần pha động, độ dày lớp pha tĩnh, loại chất kết dính, độ tinh khiết của dung môi, kích thước buồng triển khai sắc ký, độ bão hòa của buồng triển khai sắc ký, lượng mẫu sắc ký, kích thước của điểm/dải chấm, mức dung môi trong buồng, độ ẩm tương đối, nhiệt độ, khoảng dung môi khai triển sắc ký và phương thức sắc ký. Sau đây sẽ phân tích một số yếu tố chính trong số đó. 

2.1 Chất hấp phụ 

Pha tĩnh có vai trò rất quan trọng trong phân tích bằng TLC, thời gian đầu phạm vi ứng dụng của TLC không phổ biến do nhà phân tích phải tự chuẩn bị bản mỏng nên khó chuẩn hóa được bản mỏng dẫn tới độ lặp lại không cao. Tuy nhiên, từ lâu đã có các bản mỏng TLC tráng sẵn, đặc biệt là bản mỏng HPTLC với nhiều loại pha tĩnh khác nhau và chất lượng ổn định. Khi phát triển phương pháp phân tích TLC, căn cứ vào cấu trúc, đặc tính, nồng độ của chất phân tích cũng như nền mẫu để lựa chọn chất hấp phụ phù hợp. Bảng 3.2 trình bày các chất hấp phụ TLC phù hợp với đối tượng phân tích. 

Đối với HPTLC, hầu hết các bản mỏng silica gel HPTLC 60 được sản xuất từ silicagel có hình dạng hạt không đều. Mặc dù đã thu được hiệu quả tách tốt hơn rất nhiều so với TLC thông thường, nhưng để nâng cao hơn nữa chất lượng phép thử như tách tốt hơn, giảm nhiễu nền dẫn tới tăng độ nhạy thì bên cạnh giảm kích thước hạt thì chế tạo các hạt gel silica hình cầu với độ tinh khiết cao của chất hấp phụ là giải pháp mà nhiều nhà sản xuất bản mỏng đã đạt được. Hình 3.3 cho thấy hiệu quả tăng độ phân giải của quá trình tách sử dụng silica gel HPTLC hình cầu, độ tinh khiết cao. 

2.2 Pha động 

Thành phần chính của dung môi rửa giải TLC là các dung môi hữu cơ có bản chất khác nhau tùy thuộc chất phân tích và yêu cầu tách. Ngoài ra, một số chất còn được thêm vào để điều chỉnh khả năng di chuyển cũng như cải thiện khả năng tách trong quá trình sắc ký. 

2.2.1 Acid hoặc base 

Thêm acid hoặc base chính là thay đổi pH của pha động. Trong nhiều trường hợp, khả năng tách có thể được cải thiện bằng cách bổ sung acid, thường là acid acetic, acid formic hoặc acid propionic; hoặc bổ sung base, như dung dịch amoniac, triethylamin hoặc pyridin. Việc này có thể có tác dụng giảm "kéo đuôi ", dẫn đến vết sắc nét hơn, ít khuếch tán hơn, đồng thời làm thay đổi đáng kể tỷ lệ lưu giữ và đôi khi thay đổi thứ tự di chuyển của các thành phần của mẫu. Nếu các chất phân tích mang điện tích hoặc khi thay đổi pH, chúng có thể bị ion hóa hoặc triệt tiêu khả năng ion hóa, thì thêm acid hoặc base sẽ có thay đổi và cải thiện đáng kể sự phân tách sắc ký.

2.2.2 Thuốc thử tạo cặp ion 

Sử dụng thuốc thử tạo cặp ion có thể thành công trong cả việc cải thiện chất lượng của quá trình tách và thu được sự phân giải các hợp chất mà trước đây tách rất khó. Cơ sở của phương pháp dựa trên sự hình thành phức giữa các ion mang điện tích trái dấu của chất tan và ion thuốc thử trái dấu. Để xảy ra sự tạo cặp ion, chất phân tích và thuốc thử phải ở dạng ion do đó kiểm soát pH là yêu cầu quan trọng. Giá trị pH điều chỉnh phụ thuộc vào pk_a hoặc pk_b của chất phân tích. Trong TLC, thuốc thử tạo cặp có thể được sử dụng theo hai cách: 

- Lớp hấp phụ được tẩm dung dịch thuốc thử tạo cặp ion (thường được chuẩn bị trong hỗn hợp dung môi dễ bay hơi nhất mà không bị kết tủa, ở nồng độ 0,001 - 0,1 M). Sau khi làm khô, bản mỏng dùng sắc ký. 

- Mẫu được chấm lên bản mỏng theo cách thông thường và thuốc thử tạo cặp ion được cho vào pha động, thường ở nồng độ khoảng 1 - 2%. 

Thực nghiệm cho thấy cách thứ nhất cho kết quả tốt và ổn định hơn cách thứ hai. Thuốc thử tạo cặp anion đã được sử dụng thành công để tách alcaloid, phenothiazin, phenothiazin sulphoxid và thuốc nhuộm. Còn thuốc thử tạo cặp cation cũng được sử dụng cho các alcaloid và các acid thơm. Hình 3.4 trình bày kết quả tách một số alcaloid bằng HPTLC sử dụng thuốc thử tạo cặp ion. 

2.2.3 Chất chọn lọc đối quang (Chiral seletor) 

Trong những năm gần đây, khi yêu cầu kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc ở dạng đơn đồng phân tăng lên, bên cạnh phương pháp HPLC hoặc điện di mao quản, TLC cũng được nghiên cứu phát triển. Một số chất chọn lọc đối quang cho vào pha động đã thành công trong việc tách một số lượng đáng kể các chất racemic. Trong đó, nghiên cứu nhiều nhất và thành công nhất là sử dụng thuốc thử cyclodextrin và dẫn chất. 

Sử dụng bản mỏng HPTLC pha đảo và thêm cyclodextrin (thường là B -) vào pha động được áp dụng phổ biến hơn cả. Có thể thu được độ phân giải đạt yêu cầu khi tách các chất racemic, nhưng để có độ phân giải tối ưu, nồng độ thuốc thử phải nằm trong khoảng từ 0,8 đến 0,12 M. Hạn chế khi sử dụng các cyclodextrin là chúng ít tan trong nước (1,67.10 ^-2 M ở 25°C) và thời gian triển khai kéo dài, thường từ 6 - 8 giờ. Có thể tăng độ hòa tan bằng cách hòa tan cyclodextrin trong dung dịch urê bão hòa; nồng độ lên đến 0,2 M. Các cylclodextrin biến tính như hydroxypropyl -, hydroxyethyl - và maltosyl - B - cyclodextrin dễ tan hơn trong nước (< 0,4 M). Cần lưu ý rằng khi đó pha động có độ nhớt cao và thời gian triển khai sắc ký dài (thường vượt quá 40 giờ), do đó cần cân nhắc khi ứng dụng trong phân tích thường qui. 

2.3 Dung môi pha mẫu và thể tích mẫu 

Dung môi pha mẫu, thể tích mẫu và dạng chấm mẫu có thể ảnh hưởng tới khả năng tách sắc ký. Một ví dụ tách hỗn hợp các chất màu bằng bản mỏng silica gel, pha động là toluen. Mẫu thử được pha trong methanol, toluen, hexan; thể tích mẫu là 0,5 pl và 5 ul; chấm dạng điểm và dạng vạch; phát hiện bằng cách quan sát dưới ánh sáng thường (Hình 3.5). Kết quả cho thấy dung môi có độ sôi thấp cho vết gọn hơn do khi chấm sắc ký dải mẫu ít bị loang, thể tích chấm mẫu nhỏ cũng cho vết gọn, đặc biệt nếu chấm dạng vạch cho độ phân giải giữa các vết liền kề tốt hơn. 

Khi thực hiện TLC, để thu được kết quả tách sắc ký tốt cần chú ý: 

• Pha mẫu trong dung môi không phân cực vì dung môi phân cực vết chấm có xu hướng lan rộng; 
• Dung môi dùng để hòa tan mẫu phải dễ bay hơi; 
• Khi chấm mẫu tránh xê dịch bản mỏng ảnh hưởng tới vùng mẫu chấm; -
• Thể tích mẫu thích hợp, đường kính vết càng nhỏ càng tốt. 

2.4 Độ ẩm bình khai triển sắc ký 

Độ ẩm tương đối của phòng thí nghiệm tiêu chuẩn được kiểm soát không vượt 60%. Trong phòng thí nghiệm, chất hấp phụ TLC sẽ điều chỉnh đến nồng độ hơi nước cân bằng tùy thuộc vào độ ẩm tương đối. Thường thì các tấm bản mỏng được gia nhiệt ở 120°C trong ít nhất 30 phút để đạt được hoạt tính bền vững. Tuy nhiên, bước này hiệu quả rất thấp vì khi tấm bản mỏng tiếp xúc với điều kiện xung quanh, tối đa chỉ mất vài phút để điều chỉnh hàm lượng nước của nó cân bằng với môi trường xung quanh. 

Nhiều nhà sản xuất đóng gói các tấm bản mỏng ở độ ẩm tương đối tiêu chuẩn (ví dụ: 40% RH) và khi tiếp xúc với khí quyển, tỷ lệ phần trăm hấp phụ nước của lớp pha tĩnh thường sẽ tăng lên. Nếu độ ẩm tương đối không quá 60% sẽ chỉ gây ra sự thay đổi nhỏ trong hoạt động của lớp chất hấp phụ, nhưng khi vượt quá 60% sẽ gây ra sự thay đổi rõ rệt. Do đó, để duy trì khả năng tái lập tốt, các bản mỏng phải bảo quản kín và duy trì độ ẩm môi trường phòng thí nghiệm trong khoảng làm việc tối ưu. Hơi acid và base sẽ gây ra sự thay đổi trong hoạt động của chất hấp phụ. Có thể kiểm soát độ ẩm bình triển khai bằng thiết bị có dòng không khí có độ ẩm xác định được tạo bởi dung dịch muối bão hòa. 

Những thay đổi về độ ẩm tương đối có thể ảnh hưởng đến một số yếu tố quan trọng trong TLC, như giá trị Rf, độ chọn lọc. Khi thực hiện TLC pha thuận hoặc theo cơ chế hấp phụ, tăng độ ẩm làm cho chất phân tích lưu giữ ít hơn trong quá trình triển khai và rửa giải nhanh hơn. Độ chọn lọc bị ảnh hưởng và thay đổi tỷ lệ di chuyển các chất của mẫu phân tích. Hình 3.6 minh họa ảnh hưởng của độ ẩm khi tách hỗn hợp chất màu trên bản mỏng silica gel. 

Lựa chọn độ ẩm tương đối của bình triển khai được thực hiện trong quá trình phát triển phương pháp từ đó lựa chọn điều kiện phù hợp cho phép tách các chất theo yêu cầu phân tích. 

2.5 Phát hiện 

Khi quá trình triển khai sắc ký hoàn tất, cần phải có hình ảnh trực quan của các vết trên sắc ký đồ để phát hiện và đánh giá kết quả. Nhiều hợp chất có hấp thụ ánh sáng UV hoặc có đặc tính huỳnh quang khi bị kích thích bởi tia cực tím hoặc ánh sáng nhìn thấy thì có thể phát hiện trực tiếp. Nhưng hầu hết các hợp chất không có màu rõ ràng nên phải sử dụng thuốc thử thích hợp để hiện màu. Số lượng thuốc thử phát hiện khi phân tích bằng TLC rất lớn điều đó phản ánh tính linh hoạt của kỹ thuật phát hiện. 

Phương pháp phát hiện TLC được phân thành 4 loại là không phá hủy như quan sát bằng mắt thường, ánh sáng UV, Vis, huỳnh quang; phản ứng đảo ngược như dùng hơi iod, hơi amoniac; phản ứng không đảo ngược như chất màu huỳnh quang, chỉ thị pH; phá hủy cấu trúc, dẫn chất hóa với các thuốc thử có thể thực hiện với một thuốc thử hoặc nhiều thuốc thử theo trình tự. 

Tuy nhiên, việc phun thuốc thử đòi hỏi phải sử dụng thiết bị hút hơi dung môi thích hợp vì các giọt nhỏ của thuốc thử có thể gây hại cho người phân tích hoặc độc hại cho bầu khí quyển xung quanh. Ngoài ra, khi phun có thể thuốc thử không đồng đều trên bản mỏng ảnh hưởng tới kết quả. Trong những năm gần đây, kỹ thuật nhúng được sử dụng thay thế phương pháp phun truyền thống. Thông thường dung dịch thuốc thử sẽ loãng hơn và quá trình đưa thuốc thử vào lớp pha tĩnh có thể được kiểm soát hiệu quả bằng các phương tiện tự động. Các thông số cần kiểm soát là thời gian nhúng và tốc độ nhúng nhằm đảm bảo kết quả có độ tái lập cao, có thể định lượng được. Bể chứa thuốc thử cần phải hẹp vừa đủ để lượng thuốc thử cần thiết là đủ, nhưng không hẹp đến mức làm hỏng lớp chất hấp phụ do tiếp xúc với bình. Khi sử dụng thuốc thử hiện màu cần xem xét các vấn đề: 

• Độ nhạy thu được; 
• Độ chọn lọc của thuốc thử đối với chất cần phân tích; 
• Hiệu ứng nền, đặc biệt là nơi sẽ quét quang phổ; 
• Độ ổn định của thuốc thử; 
• Độ ổn định của sắc ký đồ sau khi phun thuốc thử; 
• Sự dễ dàng khi chuẩn bị thuốc thử; 
• Các nguy cơ liên quan đến việc chuẩn bị và sử dụng thuốc thử. 

Một tính năng độc đáo khi phát hiện trong TLC là khả năng thực hiện các phản ứng trực quan hóa theo trình tự. Qui trình liên quan đến sự kết hợp của các kỹ thuật trước đó được vận hành theo từng bước. Sự kết hợp điển hình có thể bao gồm sự hấp thụ của ánh sáng nhìn thấy được, sau đó là phản ứng với thuốc thử chung, thuốc thử đặc hiệu nhóm (Hình 3.7). Trình tự sử dụng được xây dựng để không có tương tác không mong muốn nào xảy ra giữa các thuốc thử được sử dụng trong các bước độc lập. Trình tự dự kiến thường có thể được sử dụng khi biết rằng các nhóm chức cụ thể có thể có mặt trong các vùng sắc ký riêng biệt, hoặc khi cần có thêm bằng chứng về sự có mặt hoặc không có mặt của các chất phân tích cụ thể. Phản ứng theo trình tự rất hữu ích khi có một số nhóm hợp chất khác nhau có chứa nhóm chức đặc trưng của các hợp chất (Hình 3.8). Hai lĩnh vực mà qui trình hiện màu từng bước đặc biệt hữu ích là phân tích thuốc bất hợp pháp và xác định các sản phẩm tự nhiên có trong các chế phẩm thảo dược. Việc xác định có thể khó khăn khi có nhiều hợp chất có thể xảy ra cùng phản ứng. Trong trường hợp này có thể cần phải “rửa” hoặc “hủy” thuốc thử trên bản mỏng sau khi sử dụng từng loại thuốc thử để tránh nhiễm chéo ở giai đoạn tiếp theo. Có thể sử dụng máng rửa bằng cách nhúng. Dung dịch rửa sẽ phụ thuộc vào bản chất của thuốc thử được sử dụng, đặc biệt là khả năng hòa tan của nó. Thực hiện "hủy" khi màu nền được tạo ra trên lớp chất hấp phụ do sử dụng thuốc thử phát hiện đặc hiệu. “Rửa” có thể giúp thực hiện quá trình “hủy”, cũng có một số màu nền sẽ mờ dần khi có hơi acid hoặc kiềm (ví dụ: hơi amoniac trên các lớp chất hấp phụ đã được xử lý trước đó bằng acid molybdophosphoric). 

Khi đánh giá kết quả phân tích bằng TLC có thể gặp một số trường hợp sau: 

Các vết tách ra quá lớn: Kích thước các vết mẫu phụ thuộc vào đường kính mao quản do đó không được dùng mao quản có đường kính lớn hơn 1 mm, bởi các vết thu được sau khi triển khai sẽ không nhỏ hơn và thường sẽ lớn hơn kích thước của vết ban đầu. Nếu vết ban đầu có đường kính lớn hơn 2 mm, thì các chất có giá trị R tương tự có thể không đạt độ phân giải vì các vết của chúng sẽ lớn đến mức chúng sẽ chồng lên nhau đáng kể và có thể là một vết lớn. Mặt khác, các điểm nhỏ ban đầu sẽ tối đa hóa khả năng phân tách hoàn toàn các thành phần trong mẫu. 

Đường dung môi phía trước không đều: Một vấn đề phổ biến nữa là lượng dung môi ở tuyến trước không đều dọc theo bản mỏng. Thay vì một đường thẳng, tuyến dung môi phía trước có thể xuất hiện hướng lên hoặc xuống ở tâm dẫn tới các vết tách ở phía trên không đều và kết quả là giá trị K. không chính xác. Một nguyên nhân được công nhận là việc sử dụng một bình sắc ký có đáy không phẳng. Bình thủy tinh thường có đáy cong lên từ mép vào tâm. Nếu đầu dưới của tấm bản mỏng được đặt trên bề mặt cong này, hình dạng của đường dẫn dung môi có thể phản ánh hình dạng của đáy bình chứa. Do đó, điều quan trọng là sử dụng các bình sắc ký TLC đáy phẳng. Đường dung môi phía trước bị lõm cũng có thể xảy ra nếu có quá ít dung môi trong bình đang triển khai sắc ký; hoặc bản mỏng được cắt không thích hợp tức là các cạnh không vuông góc với cạnh đáy và nếu đặt bản mỏng nghiêng quá mức khi triển khai. Mặt khác, có thể xảy ra hiện tượng hiệu ứng bờ do khi cắt hai bên mép của bản mỏng bị vỡ. Do đó, cần thận trọng trong việc lựa chọn và sử dụng bình triển khai TLC là cách giảm thiểu tuyến dung môi phía trước cong. 

Kéo đuôi (Vệt): Đôi khi một chất sẽ di chuyển dọc theo tấm bản mỏng dưới dạng một vệt dài chứ không phải là một điểm rời rạc. Nguyên nhân có thể do sử dụng hệ dung môi và pha tĩnh không phù hợp, kỹ thuật chấm (do sấy quá nóng), bản chất mẫu (có nhiều Nhựa, đường), đặc biệt là lượng mẫu chấm nhiều. Lượng mẫu quá nhiều sẽ gây nên hiện tượng quá tải chất phân tích đưa lên pha tĩnh và cao hơn khả năng của dung môi có thể đẩy chúng đi. Dung môi đẩy nhiều chất nhất có thể, nhưng một lượng chất đáng kể bị bỏ lại nếu lượng mẫu quá lớn. Chất bị kéo theo dung môi để lại một vệt chất, đôi khi có thể kéo dài toàn bộ khoảng cách giữa vạch xuất phát và tuyến trước dung môi. Có thể loại bỏ hiện tượng vệt bằng cách pha loãng dung dịch chấm sắc ký cho tới nồng độ mà sau triển khai các chất được tách ra dưới dạng các vết đơn lẻ, thay vì các vệt kéo dài. 

3 Ứng dụng sắc ký lớp mỏng trong kiểm nghiệm thuốc

TLC cùng với HPTLC là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất để phân tích trong các ngành dược phẩm, hóa học lâm sàng, hóa học pháp y, hóa sinh, mỹ phẩm, phân tích thực phẩm, phân tích môi trường và các lĩnh vực khác. Đó là do có nhiều ưu điểm, ví dụ, nó là phương pháp sắc ký duy nhất cung cấp tùy chọn trình bày kết quả dưới dạng hình ảnh. Các ưu điểm khác bao gồm tính đơn giản, chi phí thấp, phân tích song song các mẫu, dung lượng mẫu cao, kết quả thu được nhanh chóng và khả năng phát hiện nhiều lần. 

Trong phân tích kiểm nghiệm thuốc, TLC đã được sử dụng trong nhiều thập kỷ để theo dõi quá trình của phản ứng trong quá trình tổng hợp thuốc, định tính, xác định độ tinh khiết của nguyên liệu và thành phẩm thuốc. Tuy nhiên, HPTLC với hệ thống trang thiết bị đồng bộ, độ chính xác cao cho phép không những định tính, xác định tạp chất mà còn định lượng để tiêu chuẩn hóa thuốc nguyên liệu và thành phẩm. 

3.1 Định tính 

Do nguyên liệu và thuốc thành phẩm có nền mẫu tương đối đơn giản, hơn nữa qui trình phân tích bằng TLC trong Dược điển đã ổn định do đó TLC được sử dụng trong hầu hết các phép thử định tính của đối tượng này. Trong thực tế rất ít chuyên luận sử dụng HPTLC để định tính nguyên liệu và thuốc thành phẩm hóa dược. Khi định tính bằng TLC, về nguyên tắc, mẫu thử được thực hiện song song với mẫu chuẩn và so sánh khoảng cách (R) chúng di chuyển với khoảng cách của chất đối chiếu đã biết, màu sắc vết trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn thực hiện song song, nếu trùng nhau thì được coi là dương tính. 

Đối với phép sắc ký thực hiện trên hệ thống HPTLC có bộ phận quét phổ (scanner), còn có thể tiến hành quét phổ hấp thụ UV - Vis tại vị trí vết chất phân tích trên sắc ký đồ để định tính. (Hình 3.9 a và c). 

Tương tự như khi định tính bằng HPLC - DAD, bộ phận scanner vừa có khả năng quét phổ trong vùng UV - Vis, đồng thời có thể thực hiện chồng phổ của vết chất phân tích tại Ra của nó trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn, nếu trùng nhau (hệ số phù hợp match/ similary index xấp xỉ bằng 1) thì được coi là dương tính. 

HPTLC có ưu điểm là có thể tách riêng chất phân tích ra khỏi các chất khác trong hỗn hợp với độ chọn lọc cao do đó đã có một số chuyên luận thuốc hóa dược trong USP yêu cầu định tính sử dụng bản mỏng HPTLC. Hình 3.10 trình bày sắc ký đồ định tính fexofenadin hydroclorid và pseudoephedrin hydroclorid trong viên nén giải phóng kéo dài chứa hai dược chất này bằng HPTLC theo USP năm 2021. 

3.2 Xác định tạp chất 

Xác định tạp của nguyên liệu hóa dược và thuốc thành phẩm bằng TLC có thể là tạp chất đã biết hoặc tạp chất chưa biết gồm tạp chất liên quan và tạp chất phân hủy. Tạp định danh hay tạp đã biết được xác định dựa vào so sánh với Ra của vết tạp chuẩn làm trên cùng bản mỏng. Khi đánh giá kết quả thường là phép thử giới hạn cũng có thể là định lượng. Đánh giá kết quả căn cứ vào đậm độ về màu sắc (cường độ vết) của vết chất phân tích tách ra trên sắc đồ. Đối với TLC cường độ vết được phát hiện bằng mắt, còn trong HPTLC, vết chất phân tích được chuyển thành dạng píc với thông số diện tích hoặc chiều cao píc tương tự HPLC. Đáp ứng phân tích tỷ lệ với lượng chất phân tích và dùng để tính kết quả định lượng hoặc bán định lượng. Sắc ký đồ chuyển từ dạng vết sang dạng pic trong HPTLC được gọi là sắc ký đồ dạng pic hay sắc ký đồ analog (Hình 3,9b). 

Để xác định giới hạn tạp bằng TLC thường thực hiện theo 2 cách như sau: 

3.2.1 Pha loãng dung dịch thử

Thông thường, yêu cầu phép phân tích phải phát hiện được vết trong sắc ký đồ do đó, thường so sánh cường độ vết thu được của dung dịch mẫu thử với dung dịch pha loãng của chất kiểm tra. Mẫu thử được chuẩn bị ở mức nồng độ cao, mẫu đối chiếu sẽ là pha loãng mẫu thử đến mức giới hạn (mẫu đối chiếu cũng có thể mẫu pha từ chất chuẩn ở mức nồng độ giới hạn). Mẫu thử được phân tích ở nồng độ cao nhằm phát hiện tất cả các tạp. Mẫu đối chiếu ở nồng độ thấp nhằm đảm bảo độ tuyển tính của hoạt chất. Đáp ứng của hoạt chất có trong mẫu có nồng độ thấp tương tự tạp chất liên quan có nồng độ cao. 

Ví dụ: Đánh giá kết quả yêu cầu “Bất cứ vết phụ (tạp) nào trong sắc ký đồ thu được từ dung dịch (1) không được đậm hơn vết trong sắc ký đồ thu được từ dung dịch (2)”. Dung dịch (1) và dung dịch (2) có chứa chất kiểm tra ở nỗng độ cao và thấp tương ứng. 

Trong USP 43, HPTLC được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để xác định tạp chất của mẫu phân tích đối với từng tạp, tổng tạp tương tự như đối với HPLC. Ví dụ xác định độ tinh khiết của nguyên liệu Cloramphenicol với dung dịch thử là dung dịch mẫu thử trong methanol nồng độ 10 mg/mL, dung dịch đối chiếu B và C là dung dịch cloramphenicol chuẩn trong methanol nồng độ 0,1 mg/mL và 0,05 mg/mL. Tiến hành chấm sắc kỷ 20 HL mỗi dung dịch lên bản mỏng và sắc ký theo điều kiện qui định. Yêu cầu không được có vết phụ nào trên sắc ký đồ của dung dịch thử có đáp ứng lớn hơn vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu B (1%) và tổng của tất cả các vết phụ trên sắc ký đồ của dung dịch thử có đáp ứng không được lớn hơn 2% tính dựa vào so sánh với đáp ứng của vết chính trên sắc ký đỗ của dung dịch đối chiếu B và C. 

3.2.2 Sử dụng chất chuẩn

Trong phép thử này, nồng độ các tạp chất được xác định dựa trên cường độ vết của tạp trong mẫu thử và đáp ứng của chuẩn tạp tương ứng. Thông thường, nồng độ dung dịch chuẩn tạp được chuẩn bị ở mức giới hạn cho phép của tạp đó. 

Ví dụ: Đánh giá kết quả yêu cầu “Bất cứ vết nào tương đương với [x] trong sắc ký đồ thu được từ dung dịch (1) không được đậm hơn màu vết trong sắc ký đồ thu được từ dung dịch (2)”. Dung dịch (1) có chứa chất kiểm tra và dung dịch (2) có chứa tạp chất đã biết. 

Khi tiến hành xác định tạp chất, cần chú ý đến độ nhạy của phương pháp và khả năng tách của hệ thống. Khi đánh giá độ phù hợp của hệ thống, trong các chuyên luận thường yêu cầu đánh giá khả năng tách rời của các vết chất phân tích của dung dịch đánh giá độ phù hợp hệ thống ở điều kiện phân tích. 

Hình 3.11 trình bày sắc ký đồ của phép thử xác định tạp chất định danh imidazol theo phương pháp sử dụng tạp chất chuẩn của nguyên liệu Sildenafil citrat theo tiêu chuẩn USP năm 2021. Dung dịch thử được chuẩn bị từ nguyên liệu sildenafil citrat có nồng độ 17,5 mg/ml trong dung môi pha mẫu. Dung dịch đối chiếu chuẩn bị từ chất đối chiếu imidazol có nồng độ 0,0175 mg/mL trong dung môi pha mẫu. Dung dịch đánh giá độ phù hợp hệ thống là dung dịch gồm sildenafil citrat và imidazol có nồng độ lần lượt là 8,525 mg/mL và 0,0175 mg/mL trong dung môi pha mẫu. Sử dụng bản mỏng HPTLC silica gel, pha động gồm methylen clorid - ethyl acetat Ethanol - amoni hydroxyd (50:30:20:1). Sau khi triển khai dung môi, sấy bản mỏng ở 100°C trong 15 phút, để nguội, cho vào bình hơi Iod tới khi xuất hiện vết màu nâu sáng, quan sát dưới đèn UV ở 254 nm. Phép thử chỉ có giá trị nếu sắc ký đồ của dung dịch đánh giá độ phù hợp hệ thống có 2 vết tách nhau rõ ràng. 

Yêu cầu: Vết tương ứng với imidazol trong dung dịch thử không được đậm hơn vết chính trong dung dịch đối chiếu (0,1%). 

3.3 Định lượng 

TLC thường chỉ được ứng dụng trong định tính, hầu như không được sử dụng trong định lượng nói chung và đối tượng thuốc nói riêng. Còn HPTLC với những cải tiến nhằm tăng độ phân giải của quá trình tách, đảm bảo độ tái lặp cũng như độ đúng của phép thử cho phép ứng dụng rộng rãi trong phân tích định lượng các chất. Việc sử dụng các thiết bị hiện đại như máy quét, máy đo mật độ vết và điều kiện buồng sắc ký được kiểm soát, chất hấp phụ đa dạng về chủng loại có độ phân giải cao với kích thước hạt nhỏ và đồng đều, khả năng kết nối với các thiết bị phát hiện khác nhau và sự phát triển của các chương trình phần mềm để thu và xử lý số liệu, tất cả làm cho HPTLC trở thành một phương pháp thay thế quan trọng cho HPLC hoặc sắc ký khí. Khi thực hiện định lượng bằng HPTLC, sắc ký đồ đều được chuyển thành dạng sắc ký đồ analog và thông số để tính toán kết quả là chiều cao hoặc diện tích pic tương tự HPLC và sắc ký khí. Việc sử dụng HPTLC được đánh giá cao và được chấp nhận trên toàn thế giới. Ngày càng có nhiều công bố các nghiên cứu sử dụng HPTLC trong định lượng thuốc được đăng tải, bao gồm kiểm tra chất lượng trong quá trình sản xuất, theo dõi độ ổn định, thậm chí trong lâm sàng. Hầu hết các phương pháp công bố được xây dựng và thẩm định theo hướng dẫn của ICH, đồng thời so sánh đánh giá với phương pháp qui định là HPLC cho thấy có độ chính xác tương đương. Trong trang web https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ có rất nhiều công bố được đăng tải về lĩnh vực này. Hình 3.12 trình bày sắc ký đồ định lượng Tenofovir disoproxil fumarat trong viên nén trong quá trình nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm theo phương pháp lão hóa cấp tốc. 

4 Ứng dụng sắc ký lớp mỏng trong phân tích dược liệu và chế phẩm đông dược 

4.1 Nguyên tắc chung 

Thuốc thảo dược có thể ở 3 dạng: dược liệu, dược liệu chế, chế phẩm đông dược. Có một số vấn đề ảnh hưởng đến chất lượng của thuốc thảo dược là: 

• Nguyên liệu có nguồn gốc đa dạng; 
• Thành phần hóa học có thể thay đổi tùy thuộc vào giai đoạn thu hái, các bộ phận của cây thu hái, mùa thu hoạch, nguồn gốc thực vật (tình trạng khu vực), qui trình chế biến, 
• Cao thường là hỗn hợp của nhiều cấu tử; 
• -Hoạt chất chính trong hầu hết các trường hợp là không xác định; 
• Phương pháp phân tích và (hoặc) chất đối chiếu có thể không có sẵn. 

HPTLC cũng như TLC là một trong những kỹ thuật phân tách linh hoạt, đáng tin cậy và tiết kiệm chi phí, lý tưởng cho việc phân tích dược liệu và chế phẩm đông dược. Các điều kiện phân tích được chuẩn hóa đảm bảo kết quả có thể lặp lại nên TLC và HPTLC đã trở thành phương pháp được lựa chọn để thực hiện phép phân tích phức tạp liên quan đến dược liệu và chế phẩm đông dược. Sự kết hợp độc đáo giữa thiết bị đo hiện đại, qui trình tiêu chuẩn hóa và cơ sở lý thuyết vững chắc cho phép phương pháp này mang lại kết quả đáng tin cậy. 

Pha tĩnh trong phân tích dược liệu và chế phẩm đông dược chủ yếu sử dụng silica gel, silica gel F2s4. Dung môi pha động được lựa chọn dựa trên vật liệu hấp phụ được sử dụng làm pha tĩnh và các đặc tính vật lý và hóa học của chất phân tích. Bảng 3.4 trình bày thành phần pha động sử dụng để tách các chất trong dược liệu bằng TLC. 

Các chất tách ra trên bản mỏng có thể phát hiện trực tiếp ở bước sóng UV 254 nm, UV 366 nm, quan sát dưới ánh sáng trắng hoặc dẫn chất hóa, 

- Phát hiện ở bước sóng UV 254 nm: Sử dụng bản mỏng có pha tĩnh trong thành phần có chất phát huỳnh quang cho phép phát hiện được bằng phương pháp này. Chất chỉ thị huỳnh quang F2s4 được kích thích với bước sóng UV ở bước sóng 254 nm và phát ra huỳnh quang màu lục. Các hợp chất hấp thụ bức xạ ở bước sóng 254 nm làm giảm sự phát xạ này trên lớp chất hấp phụ và cho điểm màu tím sẫm trên nền xanh lục ở vùng có các chất phân tích. Các hợp chất cho tín hiệu phát hiện được là những chất có liên kết đôi liên hợp như anthraglycosid, coumarin, Flavonoid, propylphenol trong tinh dầu, một số loại alcaloid như indol, isoquinolin và quinolin alcaloid,... 

- Phát hiện ở bước sóng UV 366 nm: Quan sát ở điều kiện này có thể phát hiện các anthraglycosid, coumarin, flavonoid, acid phenolcarboxylic, một số loại alcaloid. 

- Phát hiện ở ánh sáng trắng: Có thể phát hiện vùng chứa các hợp chất đã tách bằng cách quan sát màu tự nhiên của chúng dưới ánh sáng ban ngày. 

- Dẫn chất: Nhúng bản mỏng hoặc phun vào bề mặt bản mỏng sau khi triển khai sắc ký dung dịch thuốc thử thích hợp sẽ tạo thành màu đặc trưng tại vết chất phân tích được tách ra do làm thay đổi cấu trúc của chất phân tích, cho phép phát hiện được chất phân tích dễ dàng (Bảng 3.5). 

4.2 Kiểm nghiệm dược liệu và chế phẩm đông dược 

TLC và HPTLC là kỹ thuật quan trọng để phân tích định tính, bán định lượng và định lượng hóa thực vật của dược liệu và chế phẩm đông dược, DĐVN, Dược điển Trung Quốc, Dược điển Hồng Kông chủ yếu sử dụng TLC trong định tính dược liệu. DĐVN V có chuyên luận chung sử dụng bản mỏng HPTLC C18 để định tính các dầu béo. Trong những năm gần đây, HPTLC dần được phát triển thay thế TLC trong kiểm nghiệm dược liệu. USP đã có nhiều chuyên luận sử dụng HPTLC để định tính dược liệu, kiểm nghiệm sản phẩm từ thảo dược với chuẩn đối chiếu là dược liệu chuẩn hoặc chất chỉ điểm. 

Hình 3.13 trình bày sắc ký đồ định tính Nhân Sâm (Panax ginseng Araliaceae) trong cao theo Dược điển châu  u bằng HPTLC. Các chất được tách bằng bản mỏng Si 60 F254 (MilliporeSigma); pha động gồm ethyl acetate - nước - butanol (25:50:100) lấy lớp trên; chấm 4 HL dạng dải 8 mm. Dung dịch chuẩn gồm 17 ginsenosid và protopanaxadiol nồng độ 0,5 mg/mL; dung dịch thử nồng độ 0,015 g/mL. Dung môi pha mẫu là methanol. Độ ẩm bình khai triển 33%. Phát hiện bằng thuốc thử anisaldehyd bằng cách nhúng, sấy bản mỏng ở 105°C trong 5 phút, quan sát dưới ánh sáng trắng. 

HPTLC ứng dụng định lượng chất định danh trong dược liệu phục vụ kiểm tra chất lượng nhanh khi nhập hàng sản xuất, giám sát trong quá trình trồng trọt, thu hoạch và chiết xuất cũng như kiểm tra độ ổn định của sản phẩm. Ưu điểm của HPTLC là chuẩn bị mẫu đơn giản, ít gặp vấn đề nền mẫu do bản mỏng chỉ dùng một lần và khả năng tách đáp ứng yêu cầu cho phép ứng dụng rộng rãi trong định lượng dược liệu. Do nồng độ chất phân tích trong mẫu thử rất biến động nên thường sử dụng phương pháp đường chuẩn trong tính toán kết quả, mặt khác khoảng nồng độ thiết lập đường chuẩn rộng nên trong một số trường hợp sử dụng hồi qui đa thức để đảm bảo tính tuyến tính. 

Một phương pháp HPTLC thường qui đã được ứng dụng định lượng artemisinin trong kiểm tra chất lượng dược liệu Thanh hao hoa vàng. Sử dụng bản mỏng Silica gel G, dung môi rửa giải gồm toluen - ethyl acetat (95 : 5), hiện màu bằng thuốc thử 4 - dimethylaminobenzaldehyd và phát hiện ở bước sóng 520 nm. Đường chuẩn với 7 điểm nồng độ chuẩn artemisin được xây dựng trong khoảng 20 ng - 1300 ng/ dải. Dựa vào diện tích píc của chất phân tích trên sắc ký đồ của các dung dịch chuẩn, thiết lập được phương trình hồi qui kiểu Michaelis - Menten. Hàm lượng artemisinin trong mẫu dược liệu được tính dựa vào phương trình hồi qui, lượng cân, độ ẩm, độ pha loãng của mẫu thử (Hình 3.14). 

Ứng dụng HPTLC trong phân phẩm đông dược bao gồm cao chiết và dạng bản chế được phát triển mạnh ở các công phê sản xuất ở Ấn Độ. Rất nhiều qui trình thường quy HPTLC được áp dụng trong định lượng chất định danh trong các sản phẩm này. Một qui trình định lượng đồng thời corilagin, acid galic và acid elagic trong chế phẩm gồm nhiều dược liệu trong đó tiêu chuẩn hóa theo dược liệu Phyllanthus amarus (Diệp Hạ Châu). Điều kiện sắc ký sử dụng gồm: Bản mỏng silica gel 60 F254 - acid formic của Merck (10 x 10 cm); pha động: n - Butanol : nước - methanol (6:1:0,1:0,8); thời gian bão hòa: 30 phút; quãng đường khai triển: 8 cm; phát hiện: UV 283 nm. Định lượng theo phương pháp so sánh với chuẩn. Lượng chuẩn của mỗi chất là 600 ng/vết. Kết quả thử nghiệm được minh họa ở Hình 3.15. 

4.3 Phân tích sàng lọc các chất không biết trong dược liệu 

Các chất trong dược liệu thuộc các nhóm chất có cấu trúc và đặc tính khác nhau. Để phân tích sàng lọc các chất chưa biết trong dược liệu, thực nghiệm được thiết kế liên hoàn từ chuẩn bị mẫu để phân lập riêng nhóm chất, phân tích bằng TLC sàng lọc hệ thống, sau đó phát hiện sơ bộ và với thuốc thử đặc hiệu để xác định nhóm chất. Ví dụ để phân tích sàng lọc 10 nhóm chất đặc trưng trong dược liệu gồm: 

1. Alcaloid 

2. Flavonoid, acid phenolcarboxylic

3. Anthraglycosid 

4. Saponin 

5. Arbutin 

6. Tinh dầu 

7. Glycosid tim 

8. Coumarin và acid phenolcarboxylic 

9. Các chất đẳng 

10. Valepotriat 

Tiến hành chuẩn bị mẫu: Dược liệu được làm khô và làm thành bột, sau đó xử lý theo hướng dẫn ở Bảng 3.6. 

Dung dịch thử sẽ được sắc ký với bản mỏng silica gel 60Fzs4 (10 cm x 10 cm), 10 bản mỏng cho 10 nhóm. (Có thể chọn các chất chuẩn khác nhau cho mỗi nhóm thực hiện sắc ký song song để đối chiếu màu khi phát hiện). 

Pha động: thực hiện sắc ký với 2 hệ dung môi với quãng đường khoảng 8 cm. 

Hệ A: Ethyl acetat - methanol - nước (100:13,5:10) phân tích các chất phân cực (glycosid) gồm alcaloid, flavonoid, anthraglycosid, Saponin, arbutin, glycosid tim, các chất đắng 

Hệ B: Toluen - ethyl acetat (93:7) phân tích các chất thân dầu (aglycon) gồm tinh dầu, terpen, coumarin, naphthoquinon, valepotriat, acid thực vật thân dầu. 

Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được bay hơi dung môi và phát hiện để phân loại các nhóm hoạt chất: 

• Quan sát ở UV - 254 nm: Phát hiện các chất có liên kết đôi như alcaloid loại indol, isoquinolin và quinolin alcaloid, flavonoid, anthraglycosid, arbutin, propylphenol trong tinh dầu, coumarin. 
• Quan sát ở UV - 365 nm: Vùng huỳnh quang phát hiện anthraglycosid, coumarin, flavonoids, acid phenol carboxylic, một số loại alcaloid.
• Không huỳnh quang: saponin, glycosid tim, các chất đắng, terpenoid trong tinh dầu, valepotriat. 
• Phun thuốc thử: Sau khi quan sát dưới đèn UV - 254 nm và UV - 365 nm, mỗi sắc ký đồ sẽ phun với các thuốc thử đặc hiệu của nhóm chất để phân nhóm. 

4.4 Ứng dụng trong phát hiện thuốc hóa dược trộn trong chế phẩm đông 

Bên cạnh ứng dụng trong kiểm tra chất lượng, nghiên cứu dược liệu và chế phẩm đông dược, HPTLC kết nối với các bộ phận phát hiện như scanner, khối phổ, đo phổ Raman cho phép phát hiện được thuốc hóa dược trộn không khai báo trong chế phẩm đông dược. 

Nhiều nghiên cứu phát triển phương pháp HPTLC ứng dụng trong lĩnh vực này đã được công bố, các phương pháp được thẩm định, được so sánh với LC - MS/MS cho kết quả tương đương. Trong chuyên luận chung về sàng lọc các thuốc và các analog không khai báo (<2251> SCREENING FOR UNDECLARED DRUGS AND DRUG ANALOGUES) trong thực phẩm bổ sung của USP, cùng với phương pháp HPLC, LC - MS/MS, cộng hưởng từ hạt nhân thì HPTLC với bộ phận phát hiện quét phổ UV và (hoặc) khối phổ đã được sử dụng phân tích sàng lọc hoạt chất và các analog của thuốc nhóm ức chế PDE - 5. Quá trình phân tích được thực hiện như sau: 

- Dung dịch mẫu thử: Lấy một lượng mẫu tương đương với 1 đơn vị chế phẩm, gồm cả vỏ nang và màng bao viên nén hoặc khoảng 500 mg mẫu, thêm 10 mL methanol, siêu âm 30 phút.  Ly tâm hoặc lọc dung dịch và sử dụng phần dịch trong phía trên. Khi triển khai sắc ký, nếu các dải sắc ký xuất hiện quá tải và phổ UV bị biến dạng, pha loãng dung dịch mẫu 10 lần bằng methanol. 

- Dung dịch chuẩn: Dung dịch của sildenafil citrat, Tadalafil và Vardenafil hydroclorid nồng độ mỗi chất 0,2 mg/mL trong methanol. 

- Điều kiện HPTLC: Bản mỏng silica gel cỡ hạt 5 um; pha động gồm tert - Butyl methyl ether - methanol - dung dịch amoni hydroxyd 28,0% (20:2:1); thể tích mẫu: 3 uL, chấm dải 8 - mm; độ ẩm tương đối trong bình triển khai: 47%; bão hòa 20 phút; quãng đường khai triển: 6 cm; làm khổ bản mỏng sau khai triển: 5 phút dưới luồng khí lạnh. 

Điều kiện MS: chế độ ion hóa ESI dương, âm, chuyển đổi nhanh (rapid switching); khí loại dung môi (Desolvation gas): Nitơ 300 L/giờ; khí nón (Cone gas): Nz 80 L/giờ; nhiệt độ đầu dò ESI (Temperatures ESI probe): 105°C; nhiệt độ bay hơi (Temperatures Desolvation): 150°C; thế mao quản: 3,0 kV; thế cone: 50 V. 

- Phát hiện: 

+ UV 254 nm và UV 365 nm: Chất ức chế PDE - 5 xuất hiện dưới dạng các dải tối trên nền huỳnh quang ở 254 nm và thường thể hiện các sắc thái khác nhau của huỳnh quang xanh dưới UV 365 nm. Tuy nhiên, sự giống nhau về giá trị Rf giữa các dải trong dung dịch mẫu chuẩn và dung dịch mẫu thử không đảm bảo kết luận dương tính. 

+ Quét phổ UV 190 - 550 nm: Quét phổ thu được phổ UV của các dải chính trong dung dịch mẫu thử và so sánh chúng với phổ của các chất ức chế PDE - 5 trong dung dịch chuẩn và các phổ được trình bày trong Bảng 2.19 (chương 2). 

+ MS quét trong khoảng m/z 90 - 1050: Giao diện khối phổ (nếu có) có thể xác nhận định tính các dải chất phân tích bằng cách so sánh tỷ số m/z của các ion phân tử [M + HJ* hoặc [M - H] - và các mảnh với các mảnh của các chất được liệt kê trong Bảng 2.19 (chương 2). 

Trong một số năm gần đây sắc ký lớp mỏng kết hợp với quang phổ Raman tăng cường bề mặt (Surface - Enhanced Raman Scattering: SERS) đã được nghiên cứu nhiều và ứng dụng rộng rãi trong phát hiện thuốc hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược. Có rất nhiều công bố của các nhà khoa học trên thế giới, đặc biệt là của các nhà khoa học Trung Quốc, phát triển thành công phương pháp này với các thuốc hóa dược thuộc các nhóm dược lý khác nhau như giảm béo, tăng cường sinh lý, hạ đường huyết, ... trên nền chế phẩm đông dược. Sự kết hợp giữa phương pháp tách có nhiều vụ điểm, hiệu quả như HPTLC và phương pháp phổ cho nhiều thông tin về cấu trúc (phổ Raman) cho phép nâng cao khả năng xác định chính xác sự có mặt của các chất tổng hợp trộn vào chế phẩm có nền mẫu phức tạp và đa dạng như chế phẩm đông dược. Sau khi tách bằng TLC, tấm bản mỏng được để làm khô tự nhiên, các vết tách ra được quan sát ở điều kiện xác định (ánh sáng thường, UV 254 nm, UV 366 nm) và đánh dấu vết. Hỗn dịch keo bạc được nhỏ trực tiếp vào mỗi điểm được đánh dấu trên tấm TLC, Phổ SERS cho mỗi điểm phân tách được ghi lại bằng máy quang phổ Raman khi những điểm này vẫn còn ướt thu được phổ. So sánh Rf và phổ thu được của mẫu thử và chuẩn thực hiện song song để kết luận. Một nghiên cứu ở Việt Nam cũng đã thành công trong phát triển phương pháp TLC - SERS phát hiện sildenafil trên nền mẫu đông dược. Chất mẫu 5 ul, thời gian triển gạch băng bản mỏng silica gel 60 F254 (20 × 10 cm); dưới đèn UV 254 nm xác định Ra và đánh dấu vị trí. Nhỏ 1,5 ul dung dịch keo bạc (tự điều chế) lên vết được đánh dấu. Phát hiện vết bằng máy quang phổ Raman cho tín hiệu tán xạ Raman tăng cường bề mặt (SERS) bằng tia laser 632,8 nm, thời gian chiếu tia laser 60 giây, vật kính phóng đại 50 lần. Kết quả được minh họa ở Hình 3.16. 

5 Ưu điểm và nhược điểm 

5.1 Ưu điểm 

TLC cùng với HPTLC được ứng dụng rộng rãi trong phân tích nhiều đối tượng thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau, chúng có những ưu điểm sau: 

• Bản mỏng có sẵn nên dễ dàng triển khai phép phân tích; 
• Chuẩn bị mẫu đơn giản - ít gặp vấn đề về nền mẫu; 
• Không cần xử lý trước đối với môi như lọc và khử khí; 
• Tiêu thụ pha động ít cho mỗi mẫu nên thân thiện với môi trường; 
• Phân tích đồng thời mẫu thử và chuẩn - độ chính xác và độ đúng tốt hơn, hiếm khi cần chuẩn nội 
• Thời gian phân tích thấp hơn và chi phí cho mỗi mẫu phân tích ít hơn, 
• Không chịu sự ảnh hưởng từ lần phân tích trước - pha tĩnh và pha động luôn mới cho mỗi lần phân tích, không có nhiễm chéo; 
• Có thể phát hiện với nhiều chế độ khác nhau đặc hiệu cho mỗi nhóm chất; 
• Có thể thực hiện điều chế thu được chất tinh khiết nhanh chóng, đơn giản; 
• Tài liệu hóa dễ dàng; 
• Không yêu cầu trình độ cao đối với người phân tích;
• Chi phí bảo trì thấp

5.2 Nhược điểm 

Bên cạnh đó phương pháp này cũng còn có những nhược điểm: 

• Độ tái lập có thể không đạt được nếu điều kiện độ ẩm không được kiểm soát; 
• Đối với hệ TLC đơn giản chỉ có thể định tính chứ không thể định lượng được;
• Yêu cầu có chất chuẩn; 
• Độ nhạy bị ảnh hưởng do lượng mẫu thực hiện phân tích nhỏ. 

6 Kết luận 

TLC là phương pháp đơn giản, nhanh chóng, kinh tế và hiệu quả được ứng dụng rộng rãi phân tích nhiều loại đối tượng mẫu khác nhau. Qua thời gian, nó đã chứng minh được độ tin cậy của kết quả thử nghiệm và được công nhận là phương pháp thường qui để định tính, thử tinh khiết trong kiểm nghiệm thuốc hóa dược, dược liệu. 

HPTLC là dạng TLC tiên tiến nhất với việc sử dụng pha tĩnh có hiệu quả phân tách tối đa và thiết bị đo đạc hiện đại cho tất cả các bước trong qui trình phân tích cho phép giải quyết tất cả các yêu cầu phân tích bao gồm định tính, thử tinh khiết và định lượng phù hợp với các chuẩn mực qui định về phương pháp phân tích như ICH, AOAC. Cùng với TLC, HPTLC ngày càng được sử dụng rộng rãi cho các ứng dụng trong phân tích dược phẩm, dược liệu và chế phẩm đông dược. Trong số các ưu điểm của TLC là phân tích nhanh chóng, chuẩn bị mẫu đơn giản hơn, giảm yêu cầu làm sạch và quan trọng nhất là phân tích đồng thời mẫu thử và mẫu chuẩn trong các điều kiện giống hệt nhau nên có thể không cần yêu cầu đánh giá độ phù hợp của hệ thống. Sự sẵn có của các pha tĩnh khác nhau đã làm tăng ứng dụng của TLC và HPTLC đối với các mẫu đa dạng không tương thích với việc tách trên silica gel. Khả năng tách một lượng lớn mẫu đồng thời của HPTLC là duy nhất và góp phần giảm chi phí phân tích trên mỗi mẫu. Trong tương lai chắc chắn HPTLC sẽ được ứng dụng ngày càng nhiều trong phân tích dược phẩm, dược liệu và chế phẩm đông dược và sẽ ngày càng có nhiều dược điển quốc gia áp dụng phương pháp này. 

TLC và HPTLC còn được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong các tích khác như kiểm nghiệm thực phẩm, phân tích lâm sàng, hóa pháp, môi trường, ... phục vụ sản xuất và cuộc sống. 

7 Tài liệu tham khảo

1. Nguyễn Thị Kiều Anh, Phạm Thị Thanh Hà, Tạ Mạnh Hùng (2022), "Sắc ký lớp mỏng”, Một Số Phương Pháp Sắc Ký Dùng Trong Phân Tích Thuốc. Nhà xuất bản Y học, trang 107 - 134. Tải bản PDF tại đây.
2. Trần Tử An (2007). Hóa Phân tích tập 2. Nhà xuất bản Y học. 
3. Bộ Y tế (2017). Dược điển Việt Nam V. Nhà xuất bản Y học. 
4. Bộ Y tế (2018), Thông tư 32/2018/TT - BYT: Qui định việc đăng ký lưu hành thuốc, nguyên liệu làm thuốc. 
5. Anthony C Moffat, M David Osselton, Brian Widdop (2011), Clarke's Analysis of Drugs and Poisons. Pharmaceutical Press.
6. Mark F. Vitha (2017), Chromatography Principles and Instrumentation. John Wiley & Sons, Inc., Publication.
7. United States Pharmacopeia 42, 43, 44. 
8. Stavros Kromidas (2016), The HPLC Expert: Possibilities and Limitations of Modern High Performance Liquid Chromatography. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA 
9. Colinf. Poole (2015), Instrumental thin layer chromatography. Elsevier Inc.
10. Peter E. Wall (2005), Thin-layer Chromatography A Modern Practical Approach. The Royal Society of Chemistry. 
11. Guidance for industry - Bioanalytical method validation. FDA 2018. 
12. Québec Ministère de l'Environnement et de la Lutte contre les changements climatiques (2021), Protocole pour la validation d'une mesthode d'analyse en chimie, 4e édition.
13. ICH (1996): Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology 
14. Angelika Gratzfeld Hüsgen and Rainer Schuster (2011), HPLC for Food Analysis. Agilent Technologies Company. 
15. Michael W. Dong (2019), HPLC and UHPLC for practicing scientists. 2nd Edition, John Wiley & Sons, Inc. 
16. Danilo Corradini (2011), Handbook of HPLC. 2nd Edition, CRC Press 
17. Angelika Gratzfeld Hüsgen and Rainer Schuster (2011), HPLC for Food Analysis. Agilent Technologies Company.
18. Camag®, Basic tool for Thin - layer Chromatography. https://www.camag.com/  
19. Piet de Coning John Swinley (2019), A practical guide to gas analysis by gas chromatography. Elsevier Inc.