Cấu tạo của kính hiển vi quang học gồm những bộ phận nào? Cách sử dụng và bảo quản kính hiển vi quang học

Trường Đại Học Y Hà Nội - Bộ môn Khoa học xét nghiệm

Chủ biên PGS.TS.BS Đặng Thị Ngọc Dung, TS. Nguyễn Trọng Tuệ

Các tác giả tham gia biên soạn

PGS. TS. BS Đặng Thị Ngọc Dung, TS. Nguyễn Trọng Tuệ, TS. BS. Nguyễn Thúy Hương, TS. BS. Nguyễn Thị Thanh Hải

ThS. Đặng Quang Huy, Ths. BSNT. Nguyễn Quỳnh Giao, Ths. BSNT. Vũ Đức Anh, ThS. Trịnh Thị Phương Dung

Ths. BSNT. Lê Văn Toàn, Ths. BSNT. Ngô Diệu Hoa, BSNT. Phạm Thị Hương Trang, Ths. BSNT. Nguyễn Thị Thu Thảo

Ths. BS. Nguyễn Thị Hảo, CKI. Đỗ Thị Hường, CKI. Nguyễn Thúy Hà, ThS. Vũ Thị Bích Hồng

CN. Lê Thanh Thảo, CN. Nguyễn Hữu Hùng

Kính hiển vi quang học là một loại kính hiển vi sử dụng ánh sáng khả kiến để quan sát hình ảnh các vật thể nhỏ được phóng đại nhờ một hệ thống các thấu kính thủy tinh, là một thiết bị quan trọng trong khoa học và y học. Trong bài viết này, Trung Tâm Thuốc Central Pharmacy (trungtamthuoc.com) xin gửi đến bạn đọc thông tin về cấu tạo của kính hiển vi quang học, cách sử dụng và bảo quản kính hiển vi quang học.

1 Giới thiệu một số kính hiển vi trong phòng thí nghiệm

1.1 Kính hiển vi nền đen 

Nguyên tắc: Ánh sáng thường chiếu từ dưới lên, qua rìa của tụ quang nền đen, chiếu hắt vào xung quanh tiêu bản, những tia sáng này bị tiêu bản làm khúc xạ rồi đưa vào vật kính. Tiêu bản được soi sáng rực trên nền đen, giống như trong phòng tối có một tia sáng mạnh chiếu vào, giúp thấy rõ từng hạt bụi trong không khí bị tia sáng chiếu vào. 

Chức năng: quan sát hình thái và đặc tính của một số vi khuẩn mà kính hiển vi thường khó quan sát. 

1.2 Kính hiển vi đổi pha 

Nguyên tắc: ánh sáng thường bị đổi pha và biên độ dao động bởi cấu trúc đặc biệt của tụ quang kính, vật kính và thị kính. 

Chức năng: dùng quan sát rõ nét các cấu trúc nhỏ như vi nhung mao, các lớp màng.

1.3 Kính hiển vi huỳnh quang 

Nguyên tắc: chùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu bản đã nhuộm màu bằng các chất huỳnh quang. Trong tế bào, các cấu trúc khác nhau sẽ phát quang với màu sắc khác nhau. 

Chức năng: quan sát và phân biệt được các cấu trúc khác nhau trong tế bào vi sinh vật. 

1.4 Kính hiển vi điện tử 

Nguyên tắc: chùm tia điện tử bước sóng rất ngắn, năng suất phân li rất lớn nên độ phân giải cao, giúp phân biệt 2 điểm rất gần nhau. 

Chức năng: dùng quan sát virus, cấu trúc phân tử của tế bào. 

1.5 Kính hiển vi quang học 

Được đề cập trong nội dung dưới đây. 

2 Kính hiển vi quang học

2.1 Nguyên tắc 

Dùng ánh sáng có bước sóng từ 500 nm - 560 nm trong chùm ánh sáng thường để tạo năng suất phân ly lớn giúp phân biệt 2 điểm cách nhau khoảng 0,2um trở lên. Hệ thống phóng đại của kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận: Vật kính (quay về phía vật quan sát) và thị kính (quay về phía mắt nhìn). Mỗi bộ phận này là một hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp, mẫu vật cần quan sát AB được đặt trước vật kính một khoảng cách lớn hơn tiêu cự của vật kính một chút. Ảnh thật đảo ngược AB' của vật sẽ thu được ở bên kia vật kính, nằm trong khoảng tiêu cự của thị kính. Thị kính hoạt động như một kính lúp. Qua thị kính, người ta sẽ thấy ảnh ảo A"B” được phóng to lên của ảnh thật AB. 

2.2 Chức năng 

Quan sát tế bào vi sinh vật, ký sinh trùng, tế bào động vật, thực vật.

2.3 Cấu tạo 

Gồm 2 phần. 

Hệ thống cơ học gồm: giá kính gồm chân kính, thân kính, đầu kính, trụ đỡ và xoay thị kính, ổ gắn và xoay vật kính, bàn kính (giá đặt mẫu), thanh trượt di chuyển tiêu bản, ốc di chuyển thanh trượt, kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh sơ cấp (điều chỉnh thô, vĩ cấp), ốc điều chỉnh thứ cấp (tinh chỉnh, vi cấp). 

Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màn chắn sáng, nguồn chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng và/hoặc kính chiếu sáng). Ngoài ra, ở kính dùng nguồn chiếu sáng là đèn điện thì có thêm bộ phận cung cấp điện như phích cắm, dây điện, cầu chì, mạch điện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng. 

2.4 Nguyên tắc hoạt động 

Vật kính là hệ thống quang học phức tạp gồm một số thấu kính, trực tiếp phóng đại mẫu vật. Các thấu kính sắp xếp theo thứ tự, thấu kính nhỏ ngoài cùng hướng vào tiêu bản có độ phóng đại lớn nhất. Độ phóng đại của kính phụ thuộc tiêu cự, tức bán kính cong của thấu kính. Thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năng phóng đại càng lớn. 

Có 2 loại vật kính: 

• Vật kính khô độ phóng đại nhỏ như: x5, (x8), x10, x20 (x15, x25), x40 (x45). 
• Vật kính dầu có độ phóng đại lớn như: x100 (x90). 

Thị kính cũng có cấu tạo phức tạp, gồm 2 thấu kính, một hướng về mắt người xem, một hướng về vật kính. Thị kính phóng đại một lần nữa ảnh do vật kính thu vào, làm ảnh to lên, xem rõ hơn. 

Độ phóng đại của kính = độ phóng đại của vật kính x độ phóng đại của thị kính. 

Ví dụ: Độ phóng đại của vật kính: x100 

Độ phóng đại của thị kính: x10 

=>  Độ phóng đại của kính: 100 x 10 = 1.000 lần. 

Năng suất phân ly của kính quan trọng hơn độ phóng đại, và là tiêu chuẩn chính để chọn kính hiển vi. Năng suất phân ly (độ phân giải) của kính hiển vi là đại lượng cho biết khả năng phân biệt hai điểm của vật quan sát nằm sát nhau. Nếu khoảng cách giữa 2 điểm nằm càng sát nhau mà vẫn có thể phân biệt được thì năng suất phân ly của kính càng cao. 

Khoảng cách này phụ thuộc chiều dài sóng ánh sáng sử dụng, với số lượng tia sáng đi vào vật kính, được biểu hiện bằng công thức: 

λ: Độ dài bước sóng phát ra từ mẫu vật. 

n: Chỉ số chiết quang của môi trường giữa mẫu vật và vật kính. 

α: Nửa góc mở của vật kính. 

2nsinα: Trị số mở của vật kính. 

Qua đó, ta thấy muốn có độ phân ly cao phải dùng ánh sáng có bước sóng thật ngắn, hoặc dùng vật kính có trị số mở lớn. 

Nếu dùng vật kính có trị số mở 0,65 và soi với ánh sáng trắng (có bước sóng trung bình A = 0,55 km) thì khoảng cách nhỏ nhất có thể nhìn thấy rõ được là: 

d = 0,55/0,65 = 0,85 m. μ

Với những chi tiết có khoảng cách nhau dưới 0,85 μm thì người ta không phân biệt được. Trong khi đó nếu dùng thị kính có độ phóng đại lớn hơn cũng không ích gì mà phải thay vật kính khác có trị số mở lớn hơn. 

Vì A đã xác định bởi nguồn ánh sáng thấy, muốn giảm d để tăng khả năng phân tích của kính thì chỉ có cách là tăng nsina. Trong số này góc a bị giới hạn bởi nhiều sai lệch khó điều chỉnh, còn lại là chỉ số chiết quang n. Nhưng n không được cao hơn chỉ số chiết quang của các thấu kính trong vật kính, nên người ta chỉ nâng n giữa vật kính và mẫu vật bằng một chất dầu gọi là dầu bách hương (dầu cede) để đạt chỉ số chiết quang tối đa mong muốn bằng chỉ số chiết quang của thấu kính. 

n_{không khí} = 1,000 

n_{thủy tinh} = 1,515 

n_dầu soi = 1,520 

Chiết suất ánh sáng của không khí nhỏ hơn thủy tinh, nên tia sáng khi đi qua tiêu bản thủy tinh sẽ bị khúc xạ một phần. Phần phía ngoài của tia sáng do bị khúc xạ nên không đi vào được vật kính. Vật kính có độ phóng đại lớn thì đường kính của thấu kính càng nhỏ, lượng tia sáng đi vào được vật kính rất ít, nên không thấy rõ ảnh. Để hạn chế nhược điểm này ta dùng dầu soi có chiết suất ánh sáng gần bằng thủy tinh, thủy tinh và dầu soi được xem như một môi trường đồng nhất. Ánh sáng đi qua không bị khúc xạ, nên tập trung đầy đủ vào vật kính, giúp xem rõ ảnh. 

Năng suất phân ly của kính càng cao thì góc nghiêng càng lớn và bước sóng càng nhỏ. Tăng góc nghiêng bằng cách chế tạo vật kính sao cho vật quan sát (tiêu bản) được đặt gần vật kính.  

Điều chỉnh tụ quang cần lưu ý: 

• Điểm giữa của tụ quang phải trùng với trục quang học của kính. 
• Độ mở của tụ quang phải tương ứng hơn độ mở của vật kính. Vậy ta dùng màng chắn sáng điều chỉnh cho độ mở của tụ quang nhỏ đi, loại bớt ánh sáng khuếch tán làm ảnh rõ hơn (mối tương quan giữa vật kính và lá chắn điều chỉnh ánh sáng). 
• Nguồn sáng quyết định hình ảnh của tiêu bản, độ phóng đại càng cao thi nguồn sáng phải càng mạnh. 

2.5 Cách sử dụng 

Có 2 cách trong thao tác sử dụng kính hiển vi: (1) Vật kính hướng về người sử dụng kính. (2) Vật kính hướng ra phía ngoài. Dưới đây là cách sử dụng kính hiển vi mà vật kính hướng về người sử dụng. 

Trước khi sử dụng phải kiểm tra tất cả các bộ phận của kính, dùng khăn mềm để lau các bộ phận của kính (Chú ý: chỉ lau bên ngoài, không tháo rời các bộ phận của kính), để kính ngay ngắn vừa với tầm ngồi, sau đó tiến hành tuần tự các bước tiếp theo để soi tiêu bản. 

2.5.1 Bước 1: Lấy ánh sáng. 

Đối với kính hiển vi phải dùng gương để lấy ánh sáng từ bên ngoài thì làm như sau: Chọn phía sáng nhất để làm nguồn sáng, quay gương về phía nguồn sáng đã chọn (nếu ánh sáng mạnh thì dùng mặt phẳng, nếu ánh sáng yếu thì dùng mặt lõm của gương), mở que chắn sáng nếu hệ thống chắn sáng bị đóng. Mắt nhìn qua lỗ trên mâm kính, tay điều khiển gương sao cho thấy mặt trên hộp tụ quang có 1 chùm sáng mạnh là đạt yêu cầu. Xoay vật kính nhỏ nhất (vật kính 10) về trục kính (khi nghe tiếng cạch nhẹ là đã đúng vị trí). 

Mắt nhìn vào thị kính, thấy vị trường sáng tròn đều là được. Nếu vi trường chưa sáng tròn đều thì mắt nhìn vào thị kính, tay điều khiển gương cho đến khi được vi trường sáng tròn đều. 

Đối với kính hiển vi dùng ánh sáng đèn điện thì cắm dây đèn vào ổ cắm, bật công tắc, kiểm tra ánh sáng, điều khiển núm chỉnh ánh sáng ở để kính để có được ánh sáng thích hợp. Xoay vật kính nhỏ nhất (vật kính 10x) về trục kính như trên. 

2.5.2 Bước 2: Đặt tiêu bản vào mâm kính. 

Trước khi đặt tiêu bản vào mâm kính, phải chọn mặt hướng lên trên (mặt cần soi) và mặt hướng xuống dưới của tiêu bản. Mặt cần soi của tiêu bản thường có dán lamen, dán nhãn (nếu sẵn có lamen và nhãn) hoặc phải kiểm tra và xác định mặt tiêu bản cần soi khi không có lamen hoặc nhãn ghi. Lưu ý khi chuẩn bị tiêu bản cần phải đánh dấu sẵn mặt cần soi của tiêu bản bằng nhãn (mã code, ghi bằng bút...). 

Để mặt cần soi của tiêu bản lên trên, tay trái mở kẹp tiêu bản, tay phải cầm phía đầu nhãn tiêu bản, đặt tiêu bản vào mâm kính và tay trái thả kẹp giữ tiêu bản ra. Tiêu bản được giữ trên trục điều chỉnh trên mâm kính. 

Dùng ốc xe đẩy để điều chỉnh sao cho mẫu vật nằm đúng vào trục kính (giữa lỗ mâm kính). 

Chú ý: Có thể dùng điểm sáng của hộp tụ quang để làm điểm chuẩn khi điều chỉnh mẫu vật về điểm trục kính, nếu mẫu vật nhỏ quá. 

2.5.3 Bước 3: Quan sát. 

Nguyên tắc bắt buộc khi quan sát là phải quan sát được ở vật kính có độ phóng đại nhỏ, rồi mới chuyển sang quan sát ở vật kính có độ phóng đại lớn hơn kề nó. Xem tiêu bản ở vật kính x10: 

• Hạ tụ quang kính xuống dưới (tức tăng khoảng cách tụ quang với tiêu bản, thị trường mờ đi). 
• Xoay vật kính x10 vào khớp của ổ đỡ vật kính (hướng vật kính vào tụ quang). 
• Mắt nhìn vào bàn đặt tiêu bản (không nhìn vào thị kính), hai tay xoay ốc điều chỉnh sơ cấp nâng dần mâm kính lên gần vật kính (không được chạm vào tiêu bản). 
• Điều chỉnh thị kính: hai mắt vẫn nhìn vào thị kính, hai tay đồng thời điều chỉnh thị kính sao cho hình ảnh của 2 mắt trùng vào nhau là được (hai vòng tròn trùng vào nhau). 
• Đặt mắt hướng vào thị kính, hai tay xoay chậm ốc điều chỉnh sơ cấp (ốc vĩ cấp) hướng ra xa tiêu bản đến khi mắt thấy rõ dần tiêu bản mẫu vật thì dừng lại. 
• Hai tay nắm ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh rõ nhất. 
• Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quang kính với tiêu bản và màng chắn sáng sao cho ảnh rõ nhất. 

Xem tiêu bản ở vật kính x40: 

• Nâng tụ quang kính lên vừa phải (thị trường sáng hơn). 
• Xoay vật kính x40 vào khớp của ổ đỡ vật kính (hướng vật kính vào tụ quang). Đặt mắt hướng vào thị kính, có thể nhìn thấy ngay hình thái của mẫu vật (đôi khi không rõ lắm). Hai tay nắm ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh rõ nhất. 
• Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quang kính với tiêu bản và màng chắn sáng sao cho ảnh rõ nhất. 

Xem tiêu bản ở vật kính x90, ×100: 

• Nâng tụ quang kính lên sát tiêu bản, mở cường độ sáng tối đa (thị trường sáng nhất). 
• Xoay vật kính x100 vào khớp của trụ đỡ vật kính (hướng vật kính vào tụ quang). Hạ mâm kính và nhỏ một giọt dầu soi vào giữa (mẫu vật trên) tiêu bản. Mắt nhìn vào bàn đặt tiêu bản (không nhìn vào thị kính), hai tay xoay ốc điều chỉnh sơ cấp nâng dần mâm kính sao cho vật kính vừa chạm vào tiêu bản thì dừng lại. 
• Đặt mắt hướng vào thị kính, hai tay xoay chậm ốc điều chỉnh vi cấp đến khi mắt thấy rõ tiêu bản mẫu vật thì dừng lại. 

Lưu ý: Khi di chuyển vật kính quá xa, đầu vật kính không còn nhúng vào giọt dầu soi thì thị trường tối hẳn đi. Hai tay nắm ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh rõ nhất. Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quang kính với tiêu bản và chỉnh màng chắn sáng sao cho ảnh rõ nhất. 

2.6 Bảo quản 

• Sau khi sử dụng xong tắt nguồn điện, xoay vật kính có độ phóng đại thấp nhất về trục chính (nếu kính hiển vi có 1 ổ không có vật kính - khi vật kính nghỉ thì vị trí đó được quay về trục chính) tất cả các vật kính ra trước, mở kẹp tiêu bản, lấy tiêu bản ra trả về chỗ cũ, hạ mâm kính, hạ hộp tụ quang. Trường hợp phải cất kính hiển vi và tủ bảo quản nên để kính tại vị trí 15 phút rồi bê cất để tránh cháy bóng đèn kính hiển vi. Dùng hai tay bê kính cất vào tủ chống ẩm (tủ bảo quản KHV). 
• Phải giữ gìn kính luôn luôn sạch sẽ, không để bụi bẩn và hóa chất dính vào. Luôn giữ kính ở nơi khô ráo, thoáng để các bộ phận quang học không bị mốc. 
• Khi lau kính, sử dụng kính, không được tháo rời các bộ phận của kính. Không được dùng tay xoa trên mặt các thấu kính, mà nên dùng một bút lông nhỏ sạch để chải bụi ở các mặt kính hoặc dùng bông mềm, sạch để lau. 
• Nếu sử dụng vật kính x100 thì phải dùng dung dịch phù hợp thẩm vào giấy chuyên dụng để lau sạch dầu cede đầu vật kính x100. Lưu ý không nên dụng khăn lau chung vật kính dầu với các vật kính khác tránh dính dầu trong quá trình thao tác. Tránh mọi sự va chạm mạnh vào kính, không đánh đổ, đánh rơi kính. Nếu di chuyển kính ra khỏi phòng thí nghiệm, nhất thiết phải đưa kính vào hộp của nó có chèn lót cẩn thận. 
• Nếu phát hiện có 1 hư hỏng nào đó, nhất thiết không được tự ý tháo ra sửa chữa mà phải báo với cán bộ hướng dẫn biết để xử lý. 

3 Tài liệu tham khảo

1. Barbara H.Estridge & Anna P.Reynolds. (2008). Basic clinical laboratory technique 

2. James H. Jorgensen & Michael A. Pfaller. (2015). Manual of clinical microbiology 

3.  PGS. TS. BS. Đặng Thị Ngọc Dung, TS. Nguyễn Trọng Tuệ (2023). “Kính hiển vi quang học”. Kỹ thuật và thiết bị xét nghiệm y học. Nhà xuất bản y học, trang 71-87. Tải bản pdf tại đây.