6 Chỉ tiêu phân tích hóa học thực phẩm và các phương pháp phân tích

Trường ĐH Dược Hà Nội - Khoa hóa phân tích và kiểm nghiệm thuốc

 Chủ biên GS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu

Các tác giả tham gia biên soạn

PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà

PGS.TS. Lê Thị Hồng Thảo

GS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu

Kỹ thuật phân tích hóa học thực phẩm nhằm phân tích các chỉ tiêu: protein, chất béo, carbohydrat, tro toàn phần, độ ẩm, một số độc chất trong thực phẩm. Trong bài viết này, Trung Tâm Thuốc Central Pharmacy (trungtamthuoc.com) xin gửi đến bạn đọc các phương pháp phân tích hóa học thực phẩm.

1 Các phương pháp phân tích Protein trong thực phẩm 

1.1 Protein trong thực phẩm 

Protein rất quan trọng đối với tế bào và các chức năng sinh học. Protein trong thực phẩm rất phức tạp. Phân tử protein có khối lượng từ khoảng 5.000 - 1.000.000 dalton và cấu tạo chủ yếu bởi các nguyên tố C, H, O, S và đặc biệt là nitơ (N). Vì vậy, protein trước đây thường được gọi là chất đạm (vì khí nitơ trước đây gọi là đạm khí, cũng như oxy được gọi là dưỡng khí, hydro là khinh khí). Hầu hết nitơ trong thực phẩm có nguồn gốc từ khoảng 20 acid amin chủ yếu. 

Hàm lượng nitơ trong protein thay đổi trong khoảng 13,4 - 19,1% tùy theo các loại protein khác nhau, trung bình khoảng 16%, do đó hàm lượng protein được tính toán dựa vào hàm lượng tổng N theo công thức: 

Protein = N × 6,25 

Việc sử dụng hệ số 6,25 (được tính theo tỷ lệ nitơ trung bình: 100/16=6,25) trong thực tế không đúng cho mọi trường hợp vì hai lý do. Thứ nhất, không phải toàn bộ nitơ trong thực phẩm đều từ protein, một phần nhỏ nitơ trong thực phẩm có thể có nguồn gốc từ một số hợp chất (như acid amin tự do, nucleotid, creatinin, cholin...) và được gọi là nguồn nitơ ngoài protein (NPN). Chỉ một phần nhỏ của NPN tham gia vào sự tổng hợp các acid amin không cần thiết. Thứ hai, hàm lượng nitơ của một số acid amin (tính theo phần trăm khối lượng) thay đổi theo khối lượng phân tử của các acid amin và số nguyên tử nitơ trong phân tử (có thể từ 1 đến 4 nguyên tử nitơ). Thành phần acid amin thay đổi theo từng loại protein, hàm lượng nitơ trong protein có thể dao động từ 13,4 đến 19,1% như đã nêu. Do đó, hệ số chuyển đổi từ nitơ tổng sang protein tổng có thể thay đổi từ 5,24 (100/19,1) đến 7,46 (100/13,4). 

Để phù hợp với thực tế, Jones (1941) đã đề nghị thay thế 6,25 bằng các hệ số chuyển đổi thích hợp cho từng đối tượng thực phẩm được phân tích. Những hệ số chuyển đổi đó được gọi là “Hệ số Jones” và đã được công nhận rộng rãi. Hệ số Jones đối với những thực phẩm thông dụng dao động từ 5,18 (các loại quả hạch, hạt) đến 6,38 (đối với sữa). Tuy nhiên, hầu hết các t phẩm có tỷ lệ NPN cao lại chứa một lượng tương đối thấp nitơ tổng số. Đối với protein động vật như thịt, sữa và trứng, hệ số chuyển đổi là từ 6,25 đến 6,38, trong khi hệ số chuyển đổi đối với các thực vật cung cấp protein chủ yếu như ngũ cốc, đậu đỗ nằm trong khoảng từ 5,7 đến 6,25. Việc sử dụng hệ số chuyển đổi cao (6,38 so với 6,25) sẽ làm hàm lượng protein tính được tăng khoảng 2% so với hàm lượng thực tế, còn nếu sử dụng hệ số chuyển đổi thấp nhất (5,7 so với hệ số 6,25) sẽ làm giảm khoảng 9% so với hàm lượng protein thực tế trong một số thực phẩm. Thực tế phân tích protein trong các thực phẩm hỗn hợp, sự khác nhau về năng lượng của protein giữa dùng hệ số 6,25 và hệ số chuyển đổi của Jones chỉ khoảng 1%. Bảng 1 đưa ra một số ví dụ về hệ số chuyển đổi của Jones đối với một số thực phẩm cụ thể. 

Bảng 1. Hệ số chuyển đổi từ nitơ tổng sang protein tổng đối với một số thực phẩm 

Nguồn: Merrill và Watt (1973). 

Hàm lượng protein trong thực phẩm thay đổi theo các loại thực phẩm khác nhau có nguồn gốc động vật và thực vật. Ví dụ, theo số liệu của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA), hàm lượng protein (không trừ hàm ẩm) trong một số loại thực phẩm: 7,1 - 7,9% (gạo), 13,7% (bột mì), 24,9% (phomat), 0,3% (táo, cả vỏ), 2,0% (khoai tây, cả vỏ), 36,5% (đậu tương, hạt), 12,6% (trứng tươi, không vỏ), 16,6% (giăm bông)... 

1.2 Khuyến cáo của FAO về xác định hàm lượng protein trong thực phẩm 

Nếu có thể, cần xác định protein trong thực phẩm bằng cách xác định tổng hàm lượng acid amin sau khi thủy phân và hàm lượng các acid amin tự do trong thực phẩm. Bảng thành phần thực phẩm cần thể hiện hàm lượng protein bằng tổng các acid amin. 

Nếu không có số liệu thành phần các acid amin, việc xác định hàm lượng protein dựa vào số liệu nitơ tổng theo phương pháp Kjeldahl hoặc phương pháp tương tự và sử dụng hệ số chuyển đổi vẫn có thể được chấp nhận. 

Cần sử dụng hệ số chuyển đổi của Jones đối với một loại thực phẩm cụ thể nếu có số liệu. Nếu không xác định được hệ số đó, cần sử dụng hệ số thông thường là 6,25 Nếu sử dụng hệ số này đối với các thực phẩm cung cấp nguồn protein chính trong chế độ ăn sẽ có một sai số về hàm lượng protein trong khoảng từ -2% đến +9%. Do protein cung cấp khoảng 15% năng lượng trong hầu hết các chế độ ăn nên việc sử dụng cách tính N x 6,25 sẽ dẫn tới sai số dưới 1% khi tính năng lượng từ protein (15% của -2% đến +9%). 

Đối với các thực phẩm sau đây, cần áp dụng phương pháp phân tích acid amin để xác định protein: 

• Các thực phẩm được dùng như nguồn dinh dưỡng duy nhất cho cơ thể, ví dụ các loại bột dinh dưỡng trẻ em. 
• Các loại thực phẩm, bột dinh dưỡng dùng trong các chế độ ăn đặc biệt. 
• Thực phẩm mới. 

1.3 Các phương pháp xác định hàm lượng protein trong thực phẩm 

Có nhiều phương pháp định lượng protein. Nguyên tắc cơ bản của các phương pháp là dựa trên việc xác định hàm lượng nitơ, lipid, dung lượng gắn phẩm màu (dye-binding capacity), hệ số hấp thụ tia UV của protein và tính chất tán xạ ánh sáng của protein hoặc dựa trên phép định lượng các acid amin bằng sắc ký khí hay sắc ký lỏng. 

Ngoài phương pháp Kjeldahl (sẽ được trình bày chi tiết dưới đây), AOAC còn đưa ra các phương pháp khác để xác định protein trong thực phẩm như: phương pháp Dumas (đốt cháy nitơ), phương pháp phổ hồng ngoại. Các phòng thí nghiệm nghiên cứu protein cũng sử dụng một số phương pháp khác. Sau đây là nguyên tắc của các phương pháp này. 

1.3.1 Phương pháp Dumas (đốt cháy nitơ) 

Phương pháp này do Jean-Baptiste Dumas đưa ra từ năm 1831 và sau này đã được cải tiến để nâng cao độ chính xác. Mẫu thử được đốt cháy ở nhiệt độ cao (700 - 1000°C) bằng một luồng oxy tinh khiết, Carbon trong mẫu cháy cho CO2 và các chất chứa nitơ biến thành khí nitơ và các oxyd của nitơ. Các nitơ oxyd chạy qua một cột đồng kim loại ở nhiệt độ cao (600°C) và bị khử thành khí nitơ, Nitơ toàn phần bao gồm cả N vô cơ như của nitrat và nitrit được heli tinh khiết đưa vào máy sắc ký khí với detector dẫn nhiệt (TCD) để định lượng. Acetanilid và EDTA (ethylendiamin tetraacetat) cực tinh khiết được dùng làm chất chuẩn để hiệu chuẩn máy phân tích nitơ. Hàm lượng protein được tính toán từ hàm lượng nitơ tổng nhân với hệ số chuyển đổi thích hợp. 

1.3.2 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 

Các dải sóng hồng ngoại giữa (6,47 mcm) và hồng ngoại gần (NIR, như 3300 - 3500 nm, 2080 - 2220 nm, 1560 - 1670 mm) đặc trưng cho liên kết peptid được dùng để xác định protein trong thực phẩm. Bằng cách chiếu lên mẫu một chùm tia IR đặc trưng cho thành phần cần xác định và đo năng lượng ánh sáng phản xạ hoặc truyền qua sẽ ước lượng được hàm lượng thành phần đó. 

1.3.3 Phương pháp Biuret 

Trong môi trường kiềm, ion Cu (II) tạo phức màu tím hồng với các liên kết lipid của protein. Đo mật độ quang của phức màu này trên máy quang phổ UV-VIS tại bước sóng 540 nm để tính toán. 

1.4 Phương pháp Kjeldahl 

Hiện nay, hàm lượng protein trong thực phẩm thường được tính từ hàm lượng nitơ tổng số được xác định bằng phương pháp Kjeldahl. Hàm lượng nitơ tổng số được nhân với một hệ số thích hợp để xác định tổng số protein. Phương pháp Kjeldahl gốc được Johann Kjeldahl xây dựng từ năm 1883. Qua nhiều năm, để xác định N trong các đối tượng khác nhau với hàm lượng khác nhau, phương pháp đã có nhiều cải tiến. Các cải tiến đó đã giúp đưa ra các phương pháp bán tự động và tự động hóa như các phương pháp của AOAC số 955.05, 976.06, 976.05 và 960.52. 

Nguyên tắc, cách tiến hành và tính toán kết của phương pháp này được minh họa qua ví dụ ứng dụng trên sữa tươi và các vấn đề cần chú ý khi triển khai. 

1.4.1 Nguyên tắc 

Mẫu được vô cơ hóa ướt bằng acid sulfuric sử dụng chất xúc tác Đồng Sulfat để giải phóng nitơ từ protein thành dạng muối amoni.

Thêm natri hydroxyd đặc để giải phóng NH3, sau đó cất kéo vào dung dịch Acid Boric và chuẩn độ để xác định hàm lượng nitơ toàn phần. 

Các hóa chất phải đủ tiêu chuẩn và đặc biệt không được chứa nitơ

1.4.2 Cách tiến hành 

* Chuẩn bị mẫu: 

Cho K2SO4 và CuSO4.5H2O và vài viên đá bọt vào ống Kjeldahl. Làm nóng mẫu sữa đến khoảng 38°C và trộn đều. Cân mẫu (ghi lượng cân chính xác tới 0,1 mg) và chuyển ngay vào bình Kjeldahl. 

Thêm H2SO4, nếu còn mẫu dính ở cổ hoặc thành ống, cần rửa hết xuống đáy. Có thể đậy nắp ống Kjeldahl và chờ đến khi vô cơ hóa. Tiến hành song song đối với mẫu trắng (có đầy đủ hóa chất như trên nhưng không chứa mẫu) cùng thời gian với mẫu thử. 

* Các bước tiến hành: 

+ Vô cơ hóa mẫu: 

Ban đầu, đặt nhiệt độ của bếp vô cơ hóa mẫu thấp (khoảng 180 - 230°C) để giảm sự trào bọt ra ngoài. Đốt trong 30 phút đến khi có khói trắng. Tăng nhiệt độ lên 410 - 430°C và đốt đến khi mẫu trắng. Chú ý không để bọt sôi lên quá cao (cần cách bộ phận hút khí ít nhất 4 - 5 cm). Sau khi mẫu trắng hoàn toàn, tiếp tục đốt ít nhất 1 giờ nữa. Tổng thời gian đốt mẫu khoảng 1,75 - 2,5 giờ. 

Sau khi vô cơ hóa, mẫu phải trong suốt và không màu. Để nguội, có thể thấy toàn là một dung dịch đồng nhất và có vài tinh thể ở đáy ống. Nếu có quá nhiều tinh thể ở đáy là biểu hiện H2SO4 quá ít và có thể dẫn đến sai số thiếu. Để giảm bớt sự mất mát acid trong quá trình vô cơ hóa, điều chỉnh để tốc độ hút khí không quá lớn. Sau khi mẫu đã trắng hoàn để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm nước cất vào mỗi ống. Với mẫu trắng lượng nước cất thêm nhiều hơn mẫu thử bằng thể tích sữa. Lắc để trộn đều, để nguội đến nhiệt độ phòng. Ở điều kiện này, trong ống có thể hình thành một số tinh thể nhưng không ảnh hưởng đến kết quả. Đậy nắp các ống chứa mẫu và chuẩn bị cho quá trình chưng cất. 

+ Chưng cất mẫu:

Chuyển dung dịch NaOH 50% (hoặc 40%) vào bình chứa trong hệ thống cất. Lắp ống chứa mẫu đã thủy phân vào hệ thống cất. Đặt bình nón 500 mL chứa dung dịch H3BO3 với chất chỉ thị vào vị trí hứng mẫu, chú ý để đầu ra ống chưng cất nhúng ngập trong dung dịch H3BO3. Lấy dịch cất thu được và chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn HCI đến khi thấy xuất hiện màu hồng nhạt. Ghi lại số mililit HCl với độ chính xác đến 0,05 mL. 

* Xác định độ thu hồi nitơ: 

Cần xác định độ thu hồi nitơ để kiểm tra độ chính xác của quy trình và thiết bị. 

+ Kiểm tra sự mất mát nitơ 

Cân ammoni sulfat và saccarose vào ống Kjeldahl. Thêm các thuốc thử khác và tiến hành như mục vô cơ hóa mẫu. Vô cơ hóa mẫu và chưng cất với cùng điều kiện như trên. Độ thu hồi phải đạt tối thiểu 99%. 

+ Kiểm tra hiệu năng của quá trình vô cơ hóa: Sử dụng lysin hydroclorid (hoặc tryptophan) 

với saccarose cho mỗi bình Kjeldahl. Tiến hành các giai đoạn vô cơ hóa và chưng cất như trên. Độ thu hồi tối thiểu phải đạt là 98%. 

1.4.3 Tính kết quả 

Hàm lượng nitơ toàn phần trong mẫu thử được tính theo công thức sau:

Nito_TP(%)= [1,4007 x (V_HCl/thu - V_HCl/trang) x N_HCl] / m_thu

Trong đó: 

• V_HCl/thu: là số mililit dung dịch chuẩn HCl dùng chuẩn độ với mẫu thử
• V_HCl/trang: là số mililit dung dịch chuẩn HCl dùng chuẩn độ với mẫu trắng
• m_thu: là lượng mẫu thử cân ban đầu (g)
• N_HCl: là nồng độ dung dịch chuẩn HCl dùng chuẩn độ (N). 

Lấy hàm lượng nitơ nhân với hệ số 6,38 để được hàm lượng protein (%). Kết hai lần phân tích song song không được sai khác quá 0,03% protein. 

* Các chú ý về an toàn: 

Acid sulfuric, natri hydroxyd, acid tricloroacetic (TCA) là các chất có thể gây bỏng nặng. Khi phân tích trong phòng thí nghiệm phải đeo kính và đi găng tay chịu acid. Nếu bị dính vào da, phải rửa ngay bằng thật nhiều nước lạnh. Không bao giờ được trung hòa acid trên da bằng dung dịch kiềm và ngược lại. 

Giai đoạn phá mẫu: phải kiểm tra đáy bình Kjeldahl trước khi đưa mẫu vào. Nếu bình có hiện tượng rạn nứt phải thay bình mới. Trong quá trình phá mẫu, cần đảm bảo khói acid bay ra phải được loại bỏ một cách hiệu quả trong hệ thống đốt mẫu. Đeo kính bảo vệ mắt và đi găng tay Cao Su khi dùng ống phá mẫu. 

Quá trình cất mẫu: quá trình cất mẫu liên quan đến việc thêm natri hydroxyd vào dung dịch mẫu đã thủy phân và phóng khí amoniac. Cần thận trọng trong giai đoạn này, phải luôn luôn sử dụng kính bảo vệ mắt và găng tay cao su mặc dù hầu hết các hệ thống cất Kjeldahl hiện nay đều có bộ phận bảo vệ. 

2 Các phương pháp phân tích chất béo trong thực phẩm 

2.1 Chất béo trong thực phẩm 

Chất béo là một trong ba nhóm thành phần chính của thực phẩm (carbohydrat, protein và chất béo)

Các chất béo (hay lipid) là nhóm các chất nói chung tan trong ether, cloroform hay các dung môi hữu cơ khác nhưng rất ít tan trong nước. Không có định nghĩa thật rõ ràng cho lipid vì tính tan thay đổi theo các nhóm lipid trong thực phẩm. 

Một số lipid như các triacylglycerol rất kỵ nước, nhưng các lipid khác như các diacylglycerol và monoacylglycerol lại có cả các thành phần ưa nước và kỵ nước trong phân tử. Các acid béo mạch ngắn như C1—C4 tan hoàn toàn trong nước và không tan trong các dung môi hữu cơ. 

Định nghĩa thường được sử dụng nhất là dựa trên tính tan như đã nêu. Lipid bao gồm một nhóm lớn các chất có những tính chất chung và sự tương tự trong thành phần. Các triacylglycerol là các chất béo và dầu đại diện cho nhóm đứng đầu trong các lipid. Các thuật ngữ mỡ (hay chất béo), lipid và dầu thường được dùng thay thế cho nhau. Lipid là tập hợp phân tử trong thực phẩm phù hợp với định nghĩa đã nêu. Mỡ thường được dùng để chỉ các lipid ở thể rắn tại nhiệt độ thường và dầu là các lipid ở thể lỏng tại nhiệt độ thưởng. FDA của Hoa Kỳ định nghĩa chất béo toàn phần là tổng các acid béo từ C4 đến C24 được tính ra triglycerid. Định nghĩa này cho phép giải quyết các tranh cãi về dán nhãn dinh dưỡng cho thực phẩm. 

Hầu hết chất béo trong chế độ ăn đều ở dạng triglycerid (ester gồm ba acid béo gắn vào một phân tử Glycerol). Ngoài ra còn có các loại chất béo khác ngoài glycerid là các sterol (như cholesterol), Các chất béo loại này được quan tâm nhiều hơn trong vai trò chuyển hóa, chúng ít quan trọng trong vai trò cung cấp năng lượng cho cơ thể. 

2.2 Các phương pháp xác định hàm lượng chất béo trong thực phẩm 

Độ chính xác của việc định tính và định lượng các lipid trong thực phẩm rất quan trọng cho việc đánh giá tính trung thực của nhãn thực phẩm và có thể gây ảnh hưởng đến nhà sản xuất. 

Hiện nay có nhiều phương pháp tiêu chuẩn để phân tích chất béo trong thực phẩm hơn so với phân tích protein và carbohydrat. Một số phương pháp chuẩn đã được công nhận trong phân tích chất béo là phương pháp khối lượng của AOAC đối với chất béo thô, bao gồm Phospholipid và các chất sáp, cũng như đã có phương pháp chuẩn để xác định các chất không phải là acid béo (AOAC 2000). Tổng số chất béo được xác định bằng tổng các acid béo có thể được tính ra triglycerid. Phương pháp này phù hợp để xác định chất béo trong hầu hết các loại thực phẩm

Cần chú ý rằng trong tính toán năng lượng, chất béo cần được hiểu là tổng số triglycerid và không bao gồm chất sáp và hàm lượng phosphat trong phospholipid, do các thành phần này không được dùng để tính năng lượng (James, Body and Smith, 1986). Phương pháp khối lượng (AOAC 2000) có thể được chấp nhận, mặc dù không thực sự tốt trong việc đánh giá năng lượng từ chất béo. 

2.3 Phương pháp chiết Soxhlet 

2.3.1 Nguyên tắc 

Chất béo trong thực phẩm được chiết bằng ether theo phương pháp chiết Soxhlet. Sau khi để bay hơi hết ether, cân chất béo còn lại và tính ra hàm lượng lipid trong 100 g thực phẩm.

2.3.2 Cách tiến hành 

Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất: Bếp cách thủy, Na2SO4 khan, HCl, ether dầu hỏa khan không chứa peroxyd và ethanol, nhiệt độ sôi 30 - 60°C. 

Chuẩn bị hệ thống Soxhlet gồm bình cầu 250 mL, ống sinh hàn thẳng hoặc ruột gà, ống hồi lưu trong có chứa một ống giấy chuyên dụng để chứa mẫu (ống thimble). Cân chính xác một lượng thực phẩm cho vào bình nón 250 mL, thêm HCl 6N, thủy phân trong 1 giờ. Sau đó lọc trên giấy lọc, tráng bình bằng nước cất nóng. Sấy giấy lọc đến khô. Thêm Na2SO4 khan vào mẫu và gói bằng giấy lọc khô để cho vào ống chiết thimble. 

Lắp dụng cụ: cho ether vào bình khoảng 2/3 thể tích. Mở nước lạnh chảy qua ống sinh hàn. Đun từ từ bình cầu cách thủy. Chiết trong 8 - 12 giờ với điều kiện số lần ether chảy từ ống hồi lưu xuống bình cầu trong 1 giờ không ít hơn 5 - 6 lần và không nhiều quá 8 - 10 lần. Khi nghỉ, giữ ống giấy ngập trong ether.

Chiết cho đến khi hết hoàn toàn lipid. Thử bằng cách nhỏ vài giọt ether lên mảnh giấy lọc, nếu sau khi để bay hơi, trên giấy lọc không có vết loang thì coi như đã chiết hết chất béo ra khỏi mẫu. Khi ether chảy hết xuống bình cầu, chuyển ether ở bình cầu vào một cốc sạch đã biết khối lượng để bay hơi hết ether ở nhiệt độ phòng hoặc trên bếp cách thủy rồi cho vào tủ sấy 105 độ C trong 1 giờ 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm, đem cân để xác định khối lượng cốc và chất béo 

2.3.3 Tính kết quả 

Hàm lượng lipid toàn phần theo phần trăm tính theo công thức: 

Lipid_TP(%) = [(P-P’) x 100] / G

Trong đó:

• P: Khối lượng của cốc có chứa chất béo (g). 
• P’: Khối lượng của cốc ban đầu (g). 
• G : Khối lượng của mẫu thử (g). 

3 Các phương pháp phân tích Carbohydrat trong thực phẩm 

3.1 Carbohydrat trong thực phẩm 

Carbohydrat là nguồn thực phẩm cung cấp năng lượng chính, tham gia cấu trúc cơ thể và là nguồn cung cấp chất xơ hỗ trợ cho các chu trình sinh lý của cơ thể. Các carbohydrat gồm monosaccarid, disaccarid, oligosaccarid (cấu tạo bởi 3 - 10 đường đơn) và polysaccarid (cấu tạo bởi 30 - 60.000 đường đơn). Trong đó, chỉ có saccarose, lactose, maltooligosaccarid, maltodextrin và tinh bột là có carbohydrat tiêu hóa được. Các carbohydrat còn lại được xếp vào nhóm chất xơ, không tiêu hóa được. Chất xơ là khái niệm hữu ích và dễ hiểu đối với người tiêu dùng, được sử dụng trong các bảng thành phần thực phẩm và nhãn thực phẩm. Tùy vào tính chất hòa tan hay không hòa tan được trong nước, các chất xơ được chia thành hai nhóm chất xơ hòa tan và không hòa tan. Nhưng vì đây là đây là tính chất vật lý, không liên quan trực tiếp đến khả năng lên men hay không lên men, nên việc phân biệt hai loại chất xơ này không có giá trị trong đánh giá năng lượng. 

3.2 Các phương pháp xác định carbohydrat trong thực phẩm 

Việc định tính và định lượng carbohydrat đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát thành phần thực phẩm và tính khẩu phần năng lượng được cung cấp (kcal). Các quy trình phân tích carbohydrat nói chung bao gồm: định tính bằng phép thử màu, định lượng đường khử bằng phản ứng Fehling với Cu(II) khử thành Cu(I), định tính bằng sắc ký giấy, định lượng dẫn chất của đường bằng sắc ký giấy và sắc ký khí (GC), định tính và định lượng bằng sắc ký lớp mỏng, bằng phương pháp enzym và bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Một số phương pháp chính thức phân tích monosaccarid và disaccarid trong thực phẩm đã được AOAC thông qua. Một số phương pháp dù cổ điển nhưng vẫn được sử dụng. Một số phương pháp hiện đại hơn tiếp tục được xây dựng và cải tiến như dùng cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), hồng ngoại gần (NIR), định lượng bằng phương pháp miễn dịch... 

Tổng lượng carbohydrat trong thực phẩm từ lâu vẫn được xác định bằng cách tính toán hơn là phân tích trực tiếp. Theo đó, lượng carbohydrat tổng được tính bằng cách lấy khối lượng thực phẩm trừ đi hàm lượng của protein, chất béo, nước, cồn và trò cộng lại. Theo cách tính này, carbohydrat tổng bao gồm cả chất xơ và một số chất có thể không phải là carbohydrat, ví dụ như các acid hữu cơ. Carbohydrat tổng có thể được xác định bằng tổng khối lượng các loại carbohydrat và chất xơ được phân tích trực tiếp. 

Carbohydrat cần được phân tích bằng một phương pháp trong đó cho phép xác định cả carbohydrat khả dụng và chất xơ. Nhằm mục đích đánh giá năng lượng, phương pháp chuẩn hóa phân tích trực tiếp các carbohydrat thành phần để xác định carbohydrat tổng thường được lựa chọn hơn là phương pháp tính toán. Phương pháp phân tích trực tiếp cho phép xác định rõ các monosaccarid và disaccarid từ tinh bột, là những thông số hữu ích khi xác định năng lượng. 

Carbohydrat tổng (CH_tổng) có thể được tính như sau: 

Bằng tính toán: 

CH_tổng = 100 - (P + L + nước + tro + Alc) 

(với P là khối lượng protein, L là khối lượng chất béo, Alc là khối lượng alcol). 

Bằng phân tích: 

CH_tổng = monoS + diS + oligoS + polyS (gồm cả chất xơ) 

(với S là saccarid như: monoS là monosaccarid). 

Carbohydrat khả dụng là các loại carbohydrat chịu tác động của men tiêu hóa người, được hấp thu và đi vào chuyển hóa. Carbohydrat khả dụng không bao gồm các chất xơ (là các chất chỉ trở thành nguồn năng lượng sau khi lên men). Carbohydrat khả dụng là một khái niệm có ích trong việc đánh giá năng lượng của chế độ ăn và cần sử dụng. Khuyến cáo này khác với quan điểm của các chuyên gia (1997), khi chấp nhận sử dụng thuật ngữ “glycaemic carbohydrat” để nói đến carbohydrat được sử dụng trong chuyển hóa (FAO, 1998). Các chuyên gia hiện nay lo ngại rằng khái niệm “glycaemic carbohydrat” có thể bị nhầm lẫn hoặc thậm chí bị hiểu tương đương với khái niệm “glycaemic index” (“chỉ số đường huyết” - là một chỉ số mô tả mối quan hệ giữa nồng độ đường huyết và các carbohydrat khả dụng). Thuật ngữ “khả dụng” có thể hiểu là “cung cấp carbohydrat cho chuyển hóa” để tránh sự nhầm lẫn. 

Có hai phương pháp xác định carbohydrat khả dụng là phương pháp phân tích trực tiếp và phương pháp tính toán theo công thức. Trong cả hai trường hợp, hàm lượng carbohydrat khả dụng có thể biểu diễn bằng khối lượng carbohydrat hoặc quy đổi thành monosaccarid. Việc xác định carbohydrat khả dụng bằng phương pháp tính toán có thể được chấp nhận để tính toán năng lượng trong hầu hết các loại thực phẩm, trừ các thực phẩm mới hoặc các thực phẩm công bố là có năng lượng thấp. Trong những trường hợp này, cần sử dụng một phương pháp phân tích trực tiếp carbohydrat khả dụng

Carbohydrat khả dụng (CH_{khả dụng}) có thể được tính như sau:

Bằng tính toán: 

CH_{khả dụng} = 100 - (P + L + nước + tro + Alc + chất xơ)

 (với P là khối lượng protein, L là khối lượng chất béo, Alc là khối lượng alcol)

Bằng phân tích: 

CH_{khả dụng} = monoS + diS + oligoS + polyS (không gồm chất xơ) 

(với S là saccarid như: monoS là monosaccarid). 

3.3 Phương pháp xác định tổng lượng đường khử trong thực phẩm 

3.3.1 Đường khử trong thực phẩm 

Đường khử là đường có chứa nhóm aldehyd (đường aldose), có thể tác dụng với chất oxy hóa tạo thành nhóm carboxylic. Phương pháp này có thể trực tiếp xác định monosaccarid, disaccarid, oligosaccarid và có thể kết hợp với phương pháp enzym để thủy phân, sau đó xác định đường khử với các polysaccarid. 

Phương pháp hay dùng nhất là sử dụng thuốc thử Fehling khử Cu(II) thành Cu(I), tạo tủa Cu2O màu đỏ gạch. 

Lượng Cu2O tạo thành được xác định bằng nhiều phương pháp: phương pháp khối lượng (AOAC 31.039), chuẩn độ với Na2S2O3 (AOAC 31.040), chuẩn độ bằng KMnO4 (31.042), chuẩn độ có mặt xanh methylen (phương pháp Lane-Eynon, AOAC 932.09, 920.183b), điện phân (AOAC 31.044) hoặc phản ứng tạo màu với arsen molypdat (từ hỗn hợp (NH4)6Mo7O24 và Na2HAsO7 trong H2SO4) rồi đo quang (phương pháp Somogyi- Nelson). Các phương pháp này đều được xác định dựa trên đường chuẩn D-glucose, vì các đường khử phản ứng khác nhau và điều kiện thí nghiệm có thể ảnh hưởng đến kết quả định lượng. Nhóm ceton không thể bị oxy hóa thành carboxylic, vì vậy đường cetose (chứa nhóm ceton) không được coi là đường khử. Tuy nhiên, trong môi trường kiềm, đường cetose được hỗ biến một phần thành đường aldose và do vậy có thể được xác định như đường khử yếu. Trong trường hợp này, đáp ứng được xác định dựa trên đường chuẩn D-fructose. Nguyên tắc, cách tiến hành và xác định kết quả của phương pháp xác định Cu2O sau phản ứng với Fe(III) và chuẩn độ bằng KMnO4 được mô tả chi tiết ở phần sau. 

Các phương pháp trên đều Chỉ Xác định được tổng lượng đường khử trong thực phẩm. Để định tính, đồng thời định lượng từng loại carbohydrat trong mẫu thực phẩm, các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại đã được sử dụng bao gồm: HPLC (loại sắc ký trao đổi ion, sắc ký phân bố pha thuận và pha đảo, với detector đo chỉ số khúc xạ, detector điện hóa hoặc dùng dẫn chất hóa trước hay sau cột cho detector UV và huỳnh quang), GC (detector ion hóa ngọn lửa FID), phương pháp enzym, khối phổ (hay dùng nhất là kỹ thuật giải hấp laser hỗ trợ nền ion hóa thời gian bay MALDI-TOF), sắc ký lớp mỏng (TLC) và điện di mao quản (CE) 

3.3.2 Nguyên tắc 

Đường khử, sau khi được thủy phân trong môi trường acid, phản ứng với thuốc thử Fehling, tạo tủa màu đỏ gạch của Cu2O. Kết tủa này khử Fe(III) thành Fe(II) trong môi trường acid. Hàm lượng đường khử tổng số được xác định bằng phương pháp chuẩn độ muối Fe(II) bằng KMnO4. Tra bảng để có số miligam đường glucose, maltose, Lactose hoặc saccarose, nhân với hệ số pha loãng để được hàm lượng đường khử tổng số trong 100 g thực phẩm. 

3.3.3 Cách tiến hành

*Thiết bị và thuốc thử: 

Phễu lọc thủy tinh G4 hoặc G3, dung dịch NaOH, HCl đặc, KMnO4, phenolphtalein trong cồn 90°, thuốc thử Fehling gồm: Fehling A (dung dịch CuSO4, trong nước hoặc H2SO4); Fehling B (dung dịch Kali natri tartrat và NaOH trong nước). Khi dùng, trộn thuốc thử Fehling A với thuốc thử Fehling B. Dung dịch Fe2(SO4)3 và H2SO4 đậm đặc trong nước (dung dịch này không được chứa FeO hoặc muối Fe(II), do đó cần oxy hóa Fe(II) bằng KMnO4 cho đến khi có màu phớt hồng. 

* Chuẩn bị dịch thử: 

Đun cách thủy thực phẩm trong dung dịch HCl trong 3 giờ, làm nguội, thêm 3 -5 giọt phenolphtalein, trung hòa bằng NaOH đến màu hồng, chuyển vào bình định mức, thêm kali ferocyanid và Kẽm acetat, lắc đều, thêm nước cất, lắc đều, lọc. 

* Xác định hàm lượng đường 

Trộn thuốc thử Fehling A và Fehling B, đun sôi, cho dịch thử chuẩn bị ở trên, đun sôi trở lại. Lấy bình ra và để nghiêng cho cặn Cu2O lắng xuống. Dung dịch bên trên phải có màu xanh của Cu(II). Nếu dung dịch bên trên có màu lục, vàng hoặc nâu, nghĩa là không đủ lượng thuốc thử Fehling cần thiết, phải làm lại và lấy một lượng dịch thử ít hơn.

Khi kết tủa Cu2O lắng xuống, gạn lấy phần nước bên trên, lọc qua phễu G3. Cho nước cất đun sôi, tiếp tục gạn đến khi hết màu xanh, hạn chế không để kết tủa rơi vào phễu và luôn luôn giữ một lớp nước cất nóng trên mặt kết tủa trong bình nón và trong phễu. Lần gạn lọc cuối cùng, gạn hết nước và thêm ngay dung dịch Fe2(SO4)3 để hòa tan hết tủa Cu2O. Rút lớp nước trên phễu, thay bình mới, hút xuống bình hứng, tráng lại bằng nước cất, hút cả xuống bình hứng. Lấy bình hứng ra, chuẩn độ Fe(II) bằng KMnO4 đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền vững trong 15 giây. Đọc lượng KMnO4 đã dùng và tra bảng để có lượng đường glucose, lactose, maltose hoặc đường nghịch chuyển tùy theo yêu cầu. 

3.3.4 Tính kết quả 

Hàm lượng đường toàn phần biểu thị theo đường Glucose hoặc đường nghịch chuyển (g/100g thực phẩm), tính theo công thức: 

Đường_TP = (G1 x 100 x f)/ (G x 1000) 

Trong đó:

• G: khối lượng thực phẩm cân lúc đầu (g) 
• G1: khối lượng đường nghịch chuyển hoặc đường glucose (mg) tương ứng với số mililit KMnO4.
• f: hệ số pha loãng. 

3.4 Phương pháp xác định tổng chất xơ trong thực phẩm 

3.4.1 Chất xơ trong thực phẩm 

Chất xơ thực phẩm (dietary fiber) là một khái niệm dinh dưỡng và sinh lý học liên quan đến các thành phần thực phẩm không khả dụng ở ruột non. Hầu hết chất xơ thực phẩm là nguyên liệu cấu tạo thành tế bào thực vật, hầu hết các polysaccarid (trừ amylose và amylopectin là phần tiêu hóa được trong tinh bột). Các chất xơ không hòa tan gồm cellulose, cellulose vi tinh thể, lignin, một số hemicellulose và tinh bột không khả dụng. Chất xơ hòa tan gồm nhiều pectin tự nhiên, hầu hết các chất keo, chất gôm thực phẩm, một số hemicellulose (không giữ trên nền lignocellulose). 

Chất xơ đi qua ruột non một cách nguyên vẹn đến ruột già, ở đó chúng có thể bị lên men (hệ vi khuẩn ruột) và sản phẩm cuối cùng của quá trình này là nhiều loại acid béo mạch ngắn và sản phẩm khí như carbon dioxyd, hydro và methan. Các acid béo mạch ngắn là nguồn cung cấp năng lượng trực tiếp và quan trọng cho lớp màng nhầy ruột già, chúng cũng có thể được hấp thu và đi vào chuỗi chuyển hóa trung gian, tuy nhiên phần năng lượng này không đáng kể nên thường bị bỏ qua khi tính toán năng lượng thực phẩm. 

Các chất xơ đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sức khỏe tối ưu, giúp chống táo bón. Chất xơ đã được chứng minh là có liên quan đến việc điều hòa mỡ máu, nhờ đó giảm nguy cơ béo phì, tăng huyết áp và bệnh tim mạch nói chung. Phần pentosan trong chất xơ giúp làm giảm nguy cơ ung thư đường ruột. Pectin và chất keo làm giảm tốc độ hấp thu đường và giảm tiết Insulin. Việc xác định hàm lượng chất xơ trong thực phẩm khá quan trọng, không chỉ do tác dụng của chất xơ, mà còn có ý nghĩa với việc tính năng lượng cho khẩu phần thực phẩm, bằng cách lấy năng lượng tính từ carbohydrat tổng trừ đi phần chất xơ. 

Nhiều phương pháp phân tích chất xơ đã được xây dựng, trong đó có phương pháp có thể xác định nhiều thành phần chất xơ khác nhau và từ đó dẫn đến nhiều định nghĩa khác nhau. Người ta đã thống kê có ít nhất 15 phương pháp khác nhau để xác định hàm lượng chất xơ trong thực phẩm được sử dụng trong các bảng thành phần thực phẩm. Tuy nhiên, nguyên tắc chính để xác định các chất xơ thực phẩm là phương pháp khối lượng. Các carbohydrat khả dụng, chất béo, protein được hòa tan, loại khỏi mẫu bằng hóa chất, dung môi, hoặc thủy phân bằng enzym phù hợp. Phần không hòa tan (không tiêu hóa) được lọc lấy, sấy và cân. 

Một phần rất quan trọng trong xử lý mẫu với phép định lượng này là loại bỏ hết tinh bột, vì đây là nguồn gây sai số dư phổ biến. Một số oligosaccarid tiêu hóa được (như từ Inulin và một số maltodextrin) cũng gây sai số thiếu do bị rửa trôi trong phần dịch hòa tan và không bị kết tủa bởi ethanol. Các chất béo thường dễ dàng loại được bằng dung môi hữu cơ nên không gây ra vấn đề trong nhân tích chất xơ. Các protein và khoáng chất không loại được trong quá trình hòa tan có thể được hiệu chỉnh bằng kết quả định lượng nitơ toàn phần và tro toàn phần. Chi tiết phương pháp khối lượng được mô tả dưới đây. 

3.4.2 Nguyên tắc 

Phương pháp của AOAC này được áp dụng đối với thực phẩm khô, đã chiết béo (nếu hàm lượng chất béo trên 10%). Mẫu được thủy phân bằng enzym Protease và amyloglucosidase để loại bỏ tinh bột và protein. Khi phân tích mẫu thức ăn chứa nhiều loại thực phẩm, cần chiết và loại béo trước khi xác định hàm lượng chất xơ. Chất xơ toàn phần được kết tủa bằng ethanol. Kết tủa được lọc, rửa bằng Ethanol 78%, ethanol 95% và aceton. Sau khi sấy khô, cân lượng kết tủa. Tiến hành song song một mẫu để xác định hàm lượng protein, một mẫu khác xác định hàm lượng tro tổng số bằng phương pháp nung ở 525°C. Hàm lượng chất xơ tổng số được tính bằng công thức: 

Xơ_tổng = Tủa − (P + tro) (với P là hàm lượng protein) 

3.4.3 Cách tiến hành 

* Thiết bị và hóa chất:

Thiết bị: bơm hút chân không cho phễu lọc, tủ sấy, bình hút ẩm, lò nung, bếp cách thủy, cân phân tích, máy đo pH. 

Hóa chất: ethanol, aceton, NaOH, HCl, đệm phosphat, dung dịch a-amylase bền với nhiệt, protease, amyloglucosidase (hoặc kit chứa ba enzym), celite, dung dịch termamyl. 

Rửa sạch phễu lọc xốp, nung, ngâm, rửa bằng nước cất. Thêm celite vào phễu đã để khô, sấy khô đến khối lượng không đổi (≥ 1 giờ), để nguội trong bình hút ẩm đến khi dùng. 

* Chuẩn bị mẫu: 

Đồng nhất mẫu thực phẩm, sấy khô qua đêm, nghiền nhỏ mẫu (nếu mẫu không thể đun nóng, đông khô để loại nước). Nếu hàm lượng chất béo quá lớn, gây khó khăn cho quá trình nghiền mẫu, loại chất béo bằng ether dầu hỏa (ba lần) trước khi nghiền. Hiệu chỉnh lại nếu bị mất mẫu trong quá trình loại chất béo. 

* Xác định hàm lượng xơ:

Cân mẫu vào cốc, thêm đệm phosphat, điều chỉnh đến pH 6,0, nếu cần. Thêm dung dịch Termamyl, đun cách thủy khoảng 30 phút, lắc nhẹ trong khi đun. Để nguội, điều chỉnh đến pH 7,5 bằng dung dịch NaOH. Thêm protease, để ở 60°C trong 30 phút, lắc liên tục. Thêm dung dịch HCl, điều chỉnh pH đến 4,0 - 4,6. Thêm amyloglucosidase, đậy nắp cốc, ủ tiếp ở 60°C trong 30 phút, lắc cốc liên tục. Thêm ethanol 95% đã để nóng trước đến 60°C. Để kết tủa ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. 

Cân và xác định khối lượng phễu lọc chứa celite (chính xác đến 0,1 mg), sau đó thấm ướt celite bằng dung dịch ethanol 78%. Hút chân không để celite được hút vào phần đĩa xốp ở giữa. Vừa để bơm hút, vừa cẩn thận cho phần kết tủa thu được ở trên vào phễu. Rửa kết tủa ba lần, bằng ethanol 78%, sau đó hai lần bằng ethanol 95%, rồi hai lần bằng aceton. Thời gian lọc và rửa có thể dao động từ 0,1 đến 6 giờ, trung bình 30 phút/mẫu. 

Sẩy phễu chứa chất xơ qua đêm ở 70°C bằng tủ sấy chân không hoặc ở 105°C bằng tủ sấy không khí. Để nguội trong bình hút ẩm, xác định khối lượng kết tủa chứa chất xơ. Làm song song hai mẫu độc lập và tiến hành song song với mẫu trắng. 

Tiến hành phân tích mẫu để xác định protein (dùng hệ số chuyển đổi từ N tổng là 6,25, trừ khi có hệ số chuyển đổi cụ thể khác đối với mẫu thực phẩm). Đồng thời xác định hàm lượng tro toàn phần (tiến hành song song) bằng phương pháp nung 5 giờ ở 525°C. 

3.4.4 Tính kết quả 

Hàm lượng chất xơ trong mẫu trắng B (mg) được tính theo công thức: 

B = M_B - P_B - A_B

Trong đó: 

• M_B là lượng kết tủa trung bình hai lần mẫu trắng song song (mg). 
• P_B và A_B là khối lượng protein và tro trong hai mẫu trắng (mg). 

Hàm lượng chất xơ toàn phần (TDF) được tính theo công thức: 

Xơ_TP (%) = [(M_s - P - A - B)/ m] × 100

Trong đó: 

• M_S là lượng kết tủa trung bình hai lần phân tích mẫu thử song song (mg).  
• P và A là khối lượng của protein và tro của hai lần phân tích mẫu (mg). 
• m là khối lượng mẫu trung bình của hai lần cân (mg). 

4 Phương pháp xác định tro toàn phần trong thực phẩm

4.1 Tro trong thực phẩm

Tro là cắn vô cơ còn lại sau khi nung hoặc sau khi các chất hữu cơ trong thực phẩm được oxy hóa hoàn toàn. Hàm lượng tro toàn phần thể hiện tổng hàm lượng khoáng chất có trong thực phẩm. Xác định tro toàn phần là bước đệm đầu tiên trước khi xác định hàm lượng một khoáng chất cụ thể, đối với các loại thực phẩm giàu khoáng chất. 

Đối với thực phẩm nguồn gốc từ động vật, hàm lượng khoáng chất thông thường là một khoảng hằng định. Còn với các thực phẩm từ thực vật, hàm lượng khoáng có thể dao động khá lớn. Tro toàn phần của các thực phẩm tươi ít khi vượt quá 5%. Với thực phẩm từ động vật, cá và hải sản có tro toàn phần lớn nhất (khoảng 2,5%), còn lại hầu hết đều ở khoảng 0,9% (như với thịt bò, thịt lợn, thịt gà, trứng). Các rau quả tươi có hàm lượng tro 0,2 - 0,6%, hoa quả khô 2,4 - 3,5% và các loại hạt 0,8 - 3,4%. 

4.2 Các phương pháp xác định tro toàn phần trong thực phẩm 

Hai phương pháp hay dùng để xác định tro là phương pháp tro hóa khô (dry ashing) và phương pháp tro hóa ướt (wet ashing). Cả hai phương pháp này có thể dùng với lò nung hoặc lò vi sóng. Các thực phẩm chứa nhiều chất béo (như thịt), cần phải được làm khô và loại chất béo trước khi xác định tro. 

Phương pháp tro hóa khô dùng lò nung ở 500 - 600°C. Nước và các chất dễ bay hơi sẽ được bay hơi hết và các chất hữu cơ được đốt cháy trong điều kiện có oxy trong không khí, thành CO2 và các oxyd của nitơ. Hầu hết khoáng chất được chuyển thành dạng oxyd, sulfat, phosphat, clorid và silicat. Một số nguyên tố như Fe, Se, Pb và Hg có thể một phần bị bay hơi theo quy trình này. Vì vậy, nếu xác định tro tổng là một bước đệm cho phân tích khoáng chất cụ thể về sau, thì cần dùng phương pháp khác để xác định tro. 

Phương pháp tro hóa ướt là quy trình oxy hóa các hợp chất hữu cơ bằng acid và các chất oxy hóa khác. Các khoáng chất được hòa tan mà không bị bay hơi. Phương pháp này thường được dùng làm bước tiền đề cho việc định lượng từng khoáng chất cụ thể. Hỗn hợp nhiều acid thường được sử dụng và nếu có dùng acid percloric thì cần có tủ hốt đặc biệt cho acid này. 

Lò vi sóng đặc biệt thiết kế cho vô cơ hóa có thể được dùng thay cho lò nung, trong cả phương pháp tro hóa khô và tro hóa ướt. Nếu phương pháp lò nung có thể tốn mất nhiều giờ thí nghiệm thì với lò vi sóng, thời gian xử lý mẫu có thể chỉ tính bằng phút. Lợi thế này làm cho việc sử dụng lò vi sóng xác định tro toàn phần ngày càng được mở rộng phạm vi trong cả các phòng thí nghiệm phân tích, lẫn phòng kiểm nghiệm của các công ty sản xuất thực phẩm. 

Lò vi sóng cho phương pháp tro hóa ướt có hai kiểu thiết kế: hệ ống kín và hệ ống hở. Hệ ống kín, chịu được áp suất cao tới 1500 psi, nhiệt độ acid có thể tới 240°C, có tới 14 ống mẫu và vô cơ hóa mẫu chỉ mất 30 phút. Hệ ống hở cho lượng mẫu lớn (tới 10 g) và cho những mẫu tạo nhiều khí trong khi vô cơ hóa, có thể xử lý 6 mẫu đồng thời. 

Lò vi sóng cho tro hóa khô, còn gọi là lò nung vi sóng, có thể đạt tới nhiệt độ rất cao (tới 1200 độ C) và giảm được 97% thời gian xử lý mẫu. Một số lò có thể chứa tới 15 chén nung và chén thạch anh có thể nguội trong vài giây mà không bị vỡ. Thời gian phân tích chỉ mất khoảng 40 phút cho những quy trình kéo dài 4 giờ, thậm chí 16 giờ khi dùng lò nung truyền thống. 

Ngoài hai phương pháp tro hóa khô và tro hóa ướt nói trên, có thể có một số phương pháp xác định tro đặc biệt: 

1) Xác định tro hòa tan và không hòa tan (AOAC 900.02) áp dụng cho hoa quả; 

2) Tro không tan trong acid để xác định tạp nhiễm trên bề mặt rau quả, gạo và lúa mì, thường là các silicat không tan trong acid, trừ HBr.

3) Độ kiềm của tro (AOAC 900.02, 940.26), tro của rau quả thường là tro kiềm, của thịt cá và ngũ cốc thường là tro acid. 

4) Tro sulfat (900,02, 950.77) áp dụng cho đường, sirô và chất màu phụ gia. 

Trong phần tiếp theo, phương pháp được dùng phổ biến nhất là tro hóa ướt sẽ được mô tả cụ thể hơn về cách tiến hành và tính kết quả, khi ứng dụng trong phân tích tro toàn phần của thực phẩm. 

4.2.1 Nguyên tắc 

Vô cơ hóa mẫu bằng lò nung ở nhiệt độ 550 - 600°C để đốt cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Hàm lượng tro toàn phần được xác định bằng phương pháp cân. 

4.2.2 Cách tiến hành 

Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất: chén nung chịu nhiệt, bếp điện, lò nung, H2O2 30% hoặc HNO3 đậm đặc. 

Nung chén sứ đã rửa sạch ở 105°C đến khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân (G). Cân mẫu thực phẩm đã đồng nhất vào chén sứ (G1), đốt trên bếp điện đến khi cháy thành than. Chuyển vào lò nung và tăng nhiệt độ lên từ từ đến 550°C. Nung cho đến tro trắng (khoảng 6 - 7 giờ). Nếu còn tro đen, để nguội, thêm vài giọt H2O2 30% hoặc HNO3 đậm đặc, nung đến tro trắng. Để nguội trong bình hút ẩm, cân (G2). 

4.2.3 Tính kết quả 

Hàm lượng tro toàn phần (% ) được tính theo công thức:

Tro_TP = [(G₂ - G) x 100]/(G₁ - G)

Trong đó:

• G: khối lượng của chén sử ban đầu (g). 
• G₁: khối lượng của chén sứ và mẫu thử (g). 
• G₂: khối lượng của chén sứ và tro trắng (g). 

5 Xác định độ ẩm trong thực phẩm

5.1 Độ ẩm của thực phẩm 

Xác định hàm ẩm có thể được coi là một trong những phép phân tích quan trọng nhất được thực hiện trên thực phẩm, nhưng cũng là một phép thử khó đạt được kết quả đúng và chính xác nhất. Hàm ẩm có giá trị rất quan trọng về mặt kinh tế, vì nước là một chất độn giá rẻ và hay được sử dụng nhất. Về an toàn thực phẩm, nếu hàm lượng nước vượt quá quy định, với một số dạng thực phẩm nhất định khả năng bảo quản sẽ giảm xuống đáng kể. 

Bên cạnh hàm ẩm, hoạt độ nước (water activity) là khái niệm có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất và bảo quản thực phẩm và được ký hiệu là a_w, Các thực phẩm có a_w cao dễ nhiễm vi sinh vật hơn. Để phát triển được, vi khuẩn cần a_w tối thiểu là 0,91 và với nấm là 0,7. Từ năm 1953, W.J. Scott đã khẳng định là vi khuẩn tăng trưởng phụ thuộc vào hoạt độ nước chứ không phải vào hàm lượng nước. Nước di chuyển từ nơi có a_w cao đến nơi có a_w thấp, ví dụ Mật Ong (a_w ~ 0,6) để ngoài không khí ẩm (a_w ~ 0,7) thì mật ong sẽ hút ẩm từ không khí. Salami/xúc xích (a_w ~ 0,87) trong không khí khô (a_w ~ 0,5) thì bị mất nước và kém chất lượng. 

Hạn dùng của một sản phẩm thực phẩm phụ thuộc vào a_w của nó. Ví dụ: với một sản phẩm có a_w đã biết, trong điều kiện ở 21°C, có thể ước lượng sản phẩm sẽ không bị mốc trong số ngày (MFSL) là 1010^7,91.aw – 1010^8,1.aw. Vì vậy trong quá trình sản xuất, phải thường xuyên định kỳ kiểm tra a_w của sản phẩm. Đây cũng là một điểm tới hạn (critical control point) trong hệ thống HACCP. 

Hoạt độ nước aw được định nghĩa là: a_w = p/p_o trong đó p là áp suất riêng phần của hơi của nước trong thực phẩm và p_o là áp suất hơi của nước tinh khiết ở cùng nhiệt độ. Có thể xác định a_w bằng một số phương pháp trong đó có phương pháp đo bằng ẩm kế sương. 

Hoạt độ nước a_w của một thực phẩm có mối quan hệ với độ ẩm tương đối (ERH) của không khí đã cân bằng với thực phẩm đó: ERH = a_w × 100%. 

Cần nhớ thêm rằng mối quan hệ giữa hoạt độ nước và hàm ẩm là phi tuyến. 

Việc loại nước khỏi mẫu thực phẩm dễ hay khó phụ thuộc vào dạng tồn tại của nước trong thực phẩm: 

• Nước tự do: dạng nước này tồn tại với trạng thái vật lý nguyên thủy của nó và là môi trường hòa tan muối, môi trường phân tán cho chất keo. 
• Nước hấp phụ: dạng nước này được hút chặt trên thành tế bào hoặc nguyên sinh chất và bám lấy các protein trên thành tế bào. 
• Nước kết tinh: dạng nước này được liên kết hóa học với phân tử các chất như: lactose monohydrat hoặc các muối như Na2SO4.10H2O. 

Tùy thuộc vào dạng tồn tại của nước trong thực phẩm mà phương pháp sử dụng để xác định hàm ẩm có thể xác định được lượng nước khác nhau. Đó là lý do các phương pháp chính thức thường phải đi kèm với quy trình tiến hành. Ví dụ, AOAC đã ban hành các phương pháp xác định hàm ẩm trong phomat: AOAC 962.08 dùng tủ sấy chân không, AOAC 977.11 dùng lò vi sóng, AOAC 969.19 dùng phương pháp cất. 

Trong phần này, một số phương pháp khác nhau dùng để xác định độ ẩm của thực phẩm sẽ được bàn luận tới cụ thể. 

5.2 Phương pháp tủ sấy 

5.2.1 Nguyên tắc

Trong phương pháp tủ sấy, mẫu được làm nóng dưới điều kiện xác định, và khối lượng giảm sau khi sấy được dùng để tính hàm ẩm của mẫu. 

Kết quả hàm ẩm xác định được phụ thuộc rất nhiều vào loại tủ sấy được dùng, điều kiện trong tủ sấy và thời gian sấy. Phương pháp này đơn giản, cho phép thực hiện đồng thời với số lượng mẫu lớn và thời gian thực hiện có thể từ vài phút đến trên 24 giờ. 

Nguyên tắc của phương pháp dựa trên nhiệt độ sôi của nước là 100 độ C, tuy nhiên nếu trong nước có chất hòa tan ở nồng độ 1 M, thì nhiệt độ sôi sẽ tăng thêm 0,512°C và tăng cao hơn nữa trong quá trình sấy khi nồng độ chất tan tăng lên. Việc loại nước sẽ hiệu quả nhất với một quy trình gồm hai giai đoạn. Các thực phẩm dạng lỏng (sữa, nước quả) thường được đun bốc hơi trên nồi cách thủy trước khi sấy trong lò. Các thực phẩm như bánh mì hay các loại hạt thường được thổi khí làm khô, nghiền mịn, rồi mới sấy trong tủ và hàm ẩm được tính cho cả giai đoạn thổi khí và sấy trong tủ. Kích thước hạt, phân bố kích cỡ hạt, cỡ mẫu và diện tích bề mặt tiếp xúc trong khi sấy là những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả làm mất nước. 

5.2.2 Cách tiến hành 

* Dụng cụ, hóa chất:

Tủ sấy, cân phân tích, nồi cách thủy, bình hút ẩm, chất hút ẩm (H2SO4 đặc, Na2SO4 khan, CaCl2 khan hoặc silicagel), cốc cân, cát sạch. 

* Tiến hành: 

Sấy cốc cân thủy tinh đựng cát và một đũa thủy tinh dẹt đầu ở 100 - 105°C đến khối lượng không đổi, để nguội, cân (G). Cho mẫu (đã xử lý trước, nếu cần) vào cốc, cân (G1). Trộn đều mẫu thử với cát, dàn mỏng. Sấy đến khối lượng không đổi (thường tối thiểu là 6 giờ). Trong thời gian sấy, nghiền nhỏ, trộn đều và dàn mỏng lại, nếu cần. Để nguội trong bình hút ẩm, cân (G2).

5.2.3 Tính kết quả 

Độ ẩm (X%) được tính bằng công thức:

X = [(G₁ - G₂) x 100]/(G₁-G)

Trong đó:

• G: khối lượng của cốc cân, cát và đũa thủy tinh ban đầu (g)
• G₁: khối lượng cốc cân, cát, đũa thủy tinh và mẫu thử trước sấy (g). 
• G₂: khối lượng cốc cân, cát, đũa thủy tinh và mẫu thử sau sấy (g). 

Sai lệch giữa kết quả hai lần xác định song song không được lớn hơn 0,5%. Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của kết quả hai lần xác định song song, tính chính xác đến 0,01%. 

5.3 Phương pháp cất hồi lưu với dung môi hữu cơ 

5.3.1 Nguyên tắc 

Kỹ thuật cất hồi lưu dùng một loại dung môi hữu cơ có nhiệt độ sôi cao hơn nước một chút, không trộn lẫn với nước và nhẹ hơn nước, Khi đun sôi dung môi đã trộn lẫn với thực phẩm, dung môi sẽ bốc hơi và kéo theo nước của thực phẩm, Dung môi và nước gặp lạnh, ngưng đọng lại ở ống đo có khắc vạch chia làm hai lớp riêng biệt. Đọc thể tích nước lắng ở phía dưới, từ đó tính ra phần trăm nước có trong thực phẩm. 

Phương pháp này thường được ứng dụng để xác định hàm lượng nước trong thực phẩm có chứa nhiều chất bay hơi, vì ít gây ra phân hủy mẫu do nhiệt so với phương pháp sấy ở nhiệt độ cao. Các phản ứng phụ không thể được loại thuốc t trừ hoàn toàn, nhưng có thể được hạn chế bằng cách dùng tinh thần dung môi có nhiệt độ sôi thấp, nhưng đồng nghĩa thời gian cất sẽ bị kéo dài. Lượng nước được xác định trực tiếp trong quy trình cất, không phải thông qua hiệu giữa các lần cân, nhưng việc đọc thể tích cất được lại không chính xác như phép cân.  

Có ba nguồn gây sai số chính trong phép đo này:

Tạo nhũ dịch keo, khó phá vỡ. Kiểm soát sai số này bằng cách để nguội thiết bị sau khi chiết và trước khi đọc lượng nước cất được.

Giọt nước đọng trên thiết bị bẩn. Cần phải đảm bảo thiết bị thủy tinh sạch hoàn toàn, nhưng vẫn không thể tránh hoàn toàn hiện tượng này. 

Mẫu bị phân hủy tạo thành phân tử nước, ví dụ các carbohydrat khi phân hủy tạo thành nước theo phương trình: (C6H12O6 → 6H2O+6C). 

5.3.2 Cách tiến hành 

Tùy theo độ ẩm của chất thử, cho mẫu thử vào chén cân khô, cân. Cho chất thử vào bình cầu đã chứa sẵn toluen, tráng bằng toluen, gộp dịch, thêm toluen, thêm bị thủy tinh hoặc đá bọt. 

Lắp máy cất, đun nóng cho toluen sôi mạnh, bốc hơi, kéo theo phần nước có trong mẫu thử và ngưng tụ với nước trong ống đo có khắc vạch. Đun đến khi mực nước trong ống đo không thay đổi. Nếu có những giọt nước đọng lại trên thành ống, dùng một chiếc đũa thủy tinh mảnh đưa giọt nước xuống. 

Trong ống đo, nước và toluen chia làm hai phần rõ rệt, nước ở phía dưới và toluen ở phía trên, sau khi để nguội, đọc thể tích nước trong ống đo. 

5.3.3 Tính kết quả 

Độ ẩm theo phần trăm (X %) tính bằng công thức: 

X = N x 100/G

• Trong đó: N: là khối lượng nước trong ống đo ((suy ra từ V đọc được, g). 
• G: khối lượng mẫu thử tính bằng g. 

5.4 Phương pháp Karl Fischer 

5.4.1 Nguyên tắc 

Phương pháp chuẩn độ Karl Fischer dựa trên phản ứng của nước với I2 và SO2 môi trường khan, theo phương trình Bunsen (1853): 

2H2O+ SO2 + I2 → H2SO4 + 2HI 

Hỗn hợp phản ứng này được cải tiến thành hỗn hợp bốn thành phần với SO2, I, pyridin và methanol, để đảm bảo phản ứng một chiều, không thuận nghịch. Tuy nhiên, do pyridin độc nên các thuốc thử Karl Fischer mới hiện nay đã thay pyridin bằng một base hữu cơ khác ít độc hơn. Phương trình phản ứng với sự có mặt dung môi khan ROH và base hữu cơ R’N được mô tả như sau: 

ROH + SO2 + R'N → [R'NH].SO3R 

[R'NH].SO3R + I2 + 2R'N + H2O → [R'NH].SO4R + 2[R'NH]I 

Chuẩn độ Karl Fischer thường chi được dùng cho các thực phẩm có kết quả hàm ẩm bị sai số lớn khi dùng phương pháp nhiệt hoặc chân không. Nếu điểm tương đương của chuẩn độ được xác định bằng mắt thường qua sự chuyển màu (không màu sang màu nâu đỏ khi dư 12), phép chuẩn độ có thể xác định hàm lượng nước > 0,03%. Nếu điểm tương đương được xác định bằng bước nhảy thế (chuẩn độ đo thể tự động, được sử dụng phổ biến nhất hiện nay cho chuẩn độ Karl Fischer), có thể xác định hàm lượng < 0,03%, cho tới mức phần triệu (ppm). 

5.4.2 Cách tiến hành 

Chuẩn độ trực tiếp có thể được tiến hành nếu mẫu thử ở dạng lỏng hoặc nước trong thực phẩm ở dạng có thể tiếp xúc với thuốc thử. Nếu mẫu thử dạng rắn và không tiếp xúc được với thuốc thử, chiết lấy nước trong mẫu (thường dùng methanol) sau đó tiến hành chuẩn độ trên dịch chiết. 

Trước khi xác định hàm lượng nước trong mẫu, cần xác định đương lượng nước của thuốc thử Karl Fischer (KFeq), là số mg nước phản ứng với 1 mL thuốc thử Karl Fischer. Do giá trị này thay đổi theo điều kiện môi trường, thuốc thử, nên giá trị KF, phải được xác định trước mỗi lần chuẩn độ Karl Fischer. Có thể xác định KF, từ mẫu chuẩn là nước tinh khiết, mẫu chuẩn nước trong methanol hoặc chất chuẩn natri tartrat dihydrat. Nước tinh khiết rất khó có thể đo chính xác lượng nhỏ, nên ít được dùng. Mẫu nước trong methanol thường được sản xuất sẵn dạng chứa 1 mg nước/1 mL dung dịch, nhưng dung dịch chuẩn này cũng gặp sai số khi bảo quản, do hấp phụ hơi ẩm trong môi trường. Natri tartrat dihydrat (Na2C4H4O6.2H2O) là chất chuẩn gốc cho việc xác định KFeq, vì hợp chất này rất bền, chứa chính xác 15,66% nước kết tinh, không thay đổi theo điều kiện bảo quản, nên là chất chuẩn hay dùng nhất. 

Tiến hành: cân chuẩn natri tartrat dihydrat, chuẩn độ trên thiết bị Karl Fischer, ghi lại đương lượng KFeq, cân mẫu thử và tiến hành chuẩn độ, ghi kết quả 

5.4.3 Tính kết quả 

Kết quả KF_eq (mg H₂O/mL) được tính như sau: 

KF_eq = (36 x m_c x 1000)/(203,08 x V_c)

Trong đó:

• m_c là khối lượng của Na₂C₄H₄O₆.2H₂O (g). 
• Vc là số mL thuốc thử Karl Fischer dùng hết để chuẩn độ Na₂C₄H₄O₆.2H₂O. 
• 36 là số mg H2O có trong 1 mol Na₂C₄H₄O₆.2H₂O. 
• 203,08 là đương lượng gam của Na₂C₄H₄O₆.2H₂O. 

Hàm lượng % nước trong mẫu được tính như sau: 

% H₂O = (KF_eq x V_T)/ m_T x 100

Trong đó:

• KF_eq là đương lượng nước của thuốc thử Karl Fischer. 
• V_T là số mL dùng hết trong chuẩn độ mẫu thử. 
• m_T là khối lượng mẫu thử đã cân (g). 

6 Xác định một số độc chất trong thực phẩm

6.1 Kỹ thuật xác định aflatoxin 

6.1.1 Nguyên tắc 

Mẫu được chiết bằng cloroform và làm sạch trên cột chiết pha rắn Si hoặc được chiết bằng hỗn hợp methanol - nước và dịch chiết được làm sạch bằng cột chiết ái lực miễn dịch. Aflatoxin được tách bởi hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột pha đảo C18 và định lượng bằng detector UV, huỳnh quang hoặc MS/MS. Quy trình này được sử dụng trong TCVN 5617:91, TCVN 7407:2004, TCVN 7930:2008, TCVN 7407:2004(Xác định aflatoxin bằng phương pháp sử dụng cột ái lực miễn dịch trong ngũ cốc, đậu đỗ và hạt có dầu), TCVN 7930:2008 (xác định aflatoxin B1 và aflatoxin tổng B1, B2, G1, G2 trong ngũ cốc, quả có vỏ và sản phẩm của chúng)

6.1.2 Cách tiến hành

* Lấy mẫu: 

Mẫu rắn được xay nhỏ, trộn đều, cân chính xác vào bình lỏng: cân khối lượng hoặc hút thể tích trực tiếp vào bình nón

* Chiết aflatoxin 

+ Chiết aflatoxin bằng cột chiết pha rắn Silica: 

Với các sản phẩm chứa ít chất béo: thêm cloroform vào mẫu đã chuẩn bị ở trên. 

- Lắc 30 phút trên máy lắc ngang. Sau đó lọc qua giấy lọc vào bình cất quay 250 mL. Dịch chiết được cô bằng máy cô quay chân không ở 40°C đến cạn. Sau đó được hòa cặn bằng 10 mL dicloromethan. 

- Với các sản phẩm nhiều chất béo: thêm hỗn hợp methanol - nước tỷ lệ thích hợp vào mẫu đã được chuẩn bị ở trên, lắc đều (30 phút trên máy lắc ngang), lọc qua giấy lọc Lấy một thể tích dịch lọc vào bình gạn, thêm dung dịch muối 1%, n-hexan, lắc để loại chất béo. Để phân lớp, lấy lớp dưới vào bình gạn khác, bỏ lớp trên. Chiết aflatoxin bằng cloroform, lấy lớp dưới, lớp trên được chiết lặp lại lần thứ hai với cloroform. Gộp dịch chiết, cất quay chân không ở 40°C đến cắn, hòa tan lại bằng dicloromethan. 

- Làm sạch trên cột SPE-Si: 

Dịch sau khi hòa cặn được làm sạch qua cột chiết pha rắn SPE - Silicagel. Cột được hoạt hóa bằng n-hexan, dicloromethan. Mẫu được nạp qua cột với tốc độ 1 - 2 mL/phút. Rửa tạp với n-hexan, dicloromethan, rửa giải bằng hỗn hợp cloroform- aceton (90:10) vào bình cất quay, cát quay đến cắn, hòa tan lại trong methanol. 

Chiết aflatoxin bằng cột ái lực miễn dịch: 

- Chiết aflatoxin trong mẫu phân tích: 

Hạt ngũ cốc và sản phẩm của chúng: cân mẫu, thêm NaCl và dung dịch MeOH 80%. Lắc ngang trong 30 phút. Lọc qua giấy lọc. Lấy một phần dịch lọc vừa thu được để tiếp tục phân tích. 

Hạt có dầu và sản phẩm của chúng: cân mẫu, thêm NaCl và dung dịch MeOH 60%. Lắc ngang trong 30 phút. Lọc qua giấy lọc. Lấy một phần dịch lọc vừa thu được để tiếp tục phân tích. 

- Làm sạch trên cột ái lực miễn dịch (SPE-IM): 

Gỡ nắp đậy phía trên và dưới cột ái lực rồi gắn vào giá đỡ của bộ chiết pha rắn, đổ dung dịch thử ở trên vào xilanh. Điều chỉnh bơm sao cho tốc độ qua cột khoảng 1 giọt/giây. Rửa tạp bằng nước, rửa giải bằng MeOH, rồi tiến hành sắc ký trên hệ thống HPLC. 

* Phân tích bằng HPLC: 

Tiến hành phân tích mẫu thử cùng với mẫu chuẩn, mẫu trắng và mẫu spike (mẫu được thêm chính xác một lượng chuẩn vào mẫu trắng). Điều kiện sắc ký: 

Cột sắc ký pha đảo C18, Waters, hoặc tương đương, 250 mm x 4,6 mm x 5 mcm 

Pha động: H2O:ACN: MeOH= 55:22,5:22,5 

Nhiệt độ buồng cột 40°C

Detector UV đo ở bước sóng: λ = 365 nm. 

Detector huỳnh quang đo ở λ_ex = 333 nm và λ_em = 454 nm. 

Thể tích bơm mẫu: 20 µl. 

Tốc độ dòng pha động: 0,8 mL/phút. 

* Phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS): 

Cột sắc ký pha đảo C18 Dionex hoặc tương đương. 

Pha động: theo chương trình gradient với hệ dung môi methanol và amoni acetat. 

Thể tích bơm mẫu: 10 µl. 

Tốc độ dòng pha động: 0,4 mL/phút 

Điều kiện khối phổ: các điều kiện khối phổ có thể khác nhau đối với các thiết bị khối phổ, cần thực hiện tối ưu điều kiện bằng chất chuẩn aflatoxin. 

6.1.3 Kiểm soát chất lượng 

Mỗi mẫu làm một lần. Thực hiện bơm mẫu theo đúng quy trình chạy máy. Mỗi lô làm ít nhất 1 mẫu thu hồi, 1 mẫu trắng: Ở nồng độ 1 - 10 ppb độ thu hồi cho phép là 40 - 120%, ở nồng độ 10 - 100 ppb độ thu hồi cho phép là 60 - 110%. Mẫu trắng phải không có tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích. 

6.2 Xác định hàm lượng chì trong thực phẩm và bao bì đựng thực phẩm 

6.2.1 Nguyên tắc 

Mẫu được vô cơ hóa trong lò vi sóng áp dụng chương trình riêng cho từng đối tượng. Xác định hàm lượng Pb trong dung dịch mẫu bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử. Đối với bao bì, dụng cụ chứa đựng thực phẩm được thôi nhiễm trong môi trường thích hợp và được xác định bằng hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử. 

Phạm vi ứng dụng là thực phẩm, nước, bao bì chứa thực phẩm, đã được đưa thành quy trình chính thức AOAC 986.15 (2000) xác định As, Cd, Pb, Se và Zn trong thực phẩm và thức ăn cho thú nuôi trong nhà. 

6.2.2 Cách tiến hành 

Thiết bị: máy quang phổ hấp thụ nguyên tử, cuvet than chì, lò vi sóng phá mẫu, cân phân tích, cân phân tích, cân kỹ thuật, bếp cách thủy, bếp khuấy từ gia nhiệt. 

Dụng cụ: giấy lọc trung tính, phễu lọc, đũa thủy tinh, micropipet. 

* Xử lý mẫu: 

- Đối với mẫu thực phẩm: 

Mẫu dạng lỏng: hút hoặc cân chính xác dịch mẫu, thêm HNO3 65%, H2O2 30% và H2O, vô cơ hóa trong lò vi sóng phá mẫu. 

Mẫu dạng rắn: cân chính xác, thêm HNO3 65%, H2O2 30% và H2O, đun trên bếp gia nhiệt cho đến khi không thấy khí NO2 bay ra, vô cơ hóa. 

Sau khi vô cơ hóa trong lò vi sóng xong, mẫu được lấy ra cốc có mỏ dung tích 100 mL và được đuổi hơi acid trên bếp cách thủy đến muối ẩm. Lấy cốc ra định mức bằng HNO3 2%, sau đó đem đo mẫu trên hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử. Trong một số trường hợp có một số mẫu phức tạp, quá trình vô cơ hóa không hoàn toàn thì có thể dùng thêm H2SO4, HF để phân hủy hoàn toàn mẫu. 

Mẫu trắng được làm tương tự như mẫu thử nhưng không chứa chất cần phân tích. Trong trường hợp không có mẫu trắng, có thể dùng mẫu trắng của thuốc thử và tiến hành tương tự như quá trình trên. 

- Đối với mẫu nước: 

Làm giàu mẫu: lấy mẫu vào cốc có mỏ, thêm HNO3 65%, bay hơi trên bếp cách thủy (dưới 100°C) đến muối ẩm. Lấy cốc ra định mức bằng HNO3 2%, đem đo trên hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử. 

Đo trực tiếp bằng cách acid hóa: thêm HNO3 65% vào bình định mức 25 mL chứa mẫu nước cần kiểm tra, sau đó đem định mức bằng chính mẫu nước cần kiểm tra đó, đo mẫu trên hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử. 

Mẫu nước có hàm lượng cao: hút lượng chính xác vào bình định mức rồi định mức tới vạch định mức bằng HNO3 2%, đo mẫu trên hệ thống AAS. 

- Đối với bao bì, dụng cụ chứa đựng thực phẩm: 

Rửa dụng cụ bằng xà phòng và tráng nhiều lần bằng nước cất, không tiếp xúc với bề mặt đồ chứa đựng thực phẩm khi đã rửa xong. Ngâm mẫu trong môi trường cần phân tích: ngâm mẫu trong H2O (60°C, 30 phút), trong n-heptan (25°C, 1 giờ), trong acid acetic 4% (25°C, 24 giờ), trong acid acetic (60°C, 30 phút), trong 20% ethanol (60°C, 30 phút). Sau khi ngâm, cô trên bếp cách thủy đến muối ẩm, định mức bằng HNO3 2%, đem đo trên hệ thống AAS. 

6.2.3 Kiểm soát chất lượng 

Kết quả phân tích hai lần song song đối với mẫu thử có sai số không được lệch quá 20% so với giá trị trung bình. Nếu sai số vượt quá 20% phải tiến hành phân tích lại. Độ thu hồi của phương pháp phải nằm trong giới hạn cho phép của AOAC: độ thu hồi từ 40 - 120% tại nồng độ 1 - 10 ppb, từ 60 - 115% tại nồng độ 10 - 100 ppb, từ 80 - 110% tại nồng độ 100 ppb - 1 ppm 

6.3 Xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong rau quả 

6.3.1 Nguyên tắc 

Dư lượng các hóa chất bảo vệ thực vật trong rau quả được chiết bằng kỹ thuật QuEChERS (viết tắt của Quick - nhanh, Easy - dễ, Cheap - rẻ tiền, Effective - hiệu quả, Rugged - ổn định và Safe - an toàn) dựa trên việc chiết lỏng lỏng với dung môi acetonitril (ACN) có bổ sung đệm acetat và muối MgSO4 giúp cho quá trình tách lớp hiệu quả. Dịch chiết được làm sạch bằng kỹ thuật chiết pha rắn phân bố (d-SPE) với chất phân bố là amin bậc một, bậc hai (PSA) và MgSO4 khan để loại bỏ các acid hữu cơ, loại nước còn thừa và những thành phần tạp khác. Dịch chiết cuối cùng được phân tích bằng LC-MS/MS. 

Phương pháp áp dụng để phân tích các hóa chất bảo vệ thực vật sau: aldicarb, carbofuran, carbaryl, carbendazim, dichlorvos, dimethoate, fenitrothion, fenobucarb, imidachlorprid, isoprocarb, methomyl, methamidofos, methiocarb, propoxur, tebuconazol, thiabendazol và triclorfon. Đối tượng áp dụng là các loại rau quả, được công bố chính thức của AOAC 2007.01, xác định dư lượng thuốc trừ sâu trong thực phẩm bằng chiết với acetonitril và phân bố với magnesi sulfat. 

6.3.2 Cách tiến hành 

* Chuẩn bị mẫu sơ bộ: 

Mẫu rau được loại bỏ phần rác bẩn, thái nhỏ và xay bằng máy đồng nhất mẫu. Mẫu quả được lấy riêng phần vỏ, sau đó thái nhỏ và xay kỹ bằng máy đồng nhất mẫu. Lượng mẫu đem đồng 

xem đồng nhất tối thiểu 200 g. Mẫu sau khi đồng nhất nên được phân tích ngay, trong trường hợp không phân tích ngay có thể bảo quản ở nhiệt độ mát 2 - 8°C, trong túi kín nhưng không được để quá 3 ngày. 

* Chuẩn bị hỗn hợp muối chiết: 

Cân MgSO4 và natri acetat trên cân kỹ thuật cho vào túi hoặc dụng cụ chứa có thể đậy kín. Lắc trộn đều. Mỗi hỗn hợp được sử dụng cho một mẫu phân tích. Chuẩn bị một loạt các hỗn hợp đảm bảo đủ cho các lô mẫu phân tích. 

* Chuẩn bị hỗn hợp chất phân bố: 

Cân PSA và MgSO4 trên cân phân tích cho vào ống ly tâm nhỏ 2 mL. Lắc trộn đều. Mỗi hỗn hợp được sử dụng cho một mẫu phân tích. Chuẩn bị một loạt các hỗn hợp đảm bảo đủ cho các lô mẫu phân tích. 

* Chuẩn bị mẫu thử: 

Cân mẫu cho vào ống ly tâm 50 mL, thêm acid acetic 1% trong acetonitril vào ống ly tâm, đậy nắp kín, lắc trộn đều bằng tay vài lần. Thêm từ từ hỗn hợp muối chiết đã được chuẩn bị sẵn, đậy nắp kín, lắc trộn đều bằng tay 1 phút. Lưu ý quá trình thêm hỗn hợp muối sẽ có hiện tượng tỏa nhiệt nhẹ. Ly tâm trong 5 phút, hút lấy lớp trên, chuyển vào ống ly tâm có hỗn hợp chất phân bố, đậy nắp, lắc 1 phút bằng máy lắc xoáy, hút lớp trên, đem phân tích bằng LC-MS/MS. 

Mẫu sau khi chiết nên được phân tích ngay, nếu không thể phân tích ngay thì có thể bảo quản ở 2 - 8°C nhưng không quá một ngày. Mẫu trắng tiến hành tương tự như mẫu thử trên mẫu rau quả đã xác định là không có các hóa chất bảo vệ thực vật nói trên. 

6.3.3 Kiểm soát chất lượng 

Phân tích hai lần song song, kết quả không được lệch quá 10 % so với giá trị trung bình, nếu không phải tiến hành phân tích lại thêm một lần nữa. Mẫu QC phải đạt độ thu hồi từ 70 đến 110%. 

7 Tài liệu tham khảo

1. Thái Nguyễn Hùng Thu, Phạm Thị Thanh Hà, Lê Thị Hồng Hảo (2023), "Kỹ thuật phân tích hóa học thực phẩm", Kiểm Nghiệm Thực Phẩm. Nhà xuất bản Y học, trang 75 - 99. Tải bản PDF tại đây.
2. Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
3. Trần Đáng (2004), Mối nguy vệ sinh an toàn thực phẩm - Chương trình kiểm soát GMP, GHP và hệ thống quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm HACCP, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 
4. Nguyễn Công Khẩn, Hà Thị Anh Đào (2007), Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam Vietnamese Food Composition Table, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 
5. Nguyễn Công Khẩn (2008), Dinh dưỡng cộng đồng và an toàn vệ sinh thực phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục. 
6. Hà Duyên Tư (2009), Phân tích hóa học thực phẩm, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội. 
7. Codex Alimentarius International Food Standards, General Standard for Food Additives Codex Stan 192 - 1995, revision 2014. 
8. Emerton V., Choi E. (2008), Essential Guide to Food Additives, Letherhead Publishing, Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK. 
9. Hurst W.J. (2008), Methods of Analysis for Functional Foods And Nutraceuticals, CRC Press, Taylor and Francis Group, Florida, USA. 
10. James M. Jay (1996). Modern food Microbiology. 5 th edition. CBS publishers and distributors, Dehli, India.
11. Lightfoot N.F., Maier E.A. (1998), Microbiological Analysis of Food and Water, Elsevier Science B.V., Asmterdam, The Netherlands. 
12. Marwaha K. (2010), Control and Analysis For Food and Agricultural Products, Gene-Tech Books, New Dehli, India. 
13. Newton D.E. (2007), Food Chemistry, Library of Congress, Infobase Publishing, New York. 
14. Nielsen S.S. (2010), Food Analysis, 4th Edition (Food Science Texts Series), Springer, London, England. 
15. Nollet L.M.L. (2009), Fidel Toldra Handbook of Dairy Foods Analysis, CRC Press, Taylor and Francis Group, Florida, USA. 
16. Nollet L.M.L. (2010), Fidel Toldra Safety Analysis of Foods of Animal Origin, CRC Press, Taylor and Francis Group, Florida, USA.
17. Rita Cornelis, Caruso J.A., Crews H., Heumann K.G. (2003), Handbook of Elemental Speciation: Techniques and Methodology, Chapter II. Techniques and Methodology for Sample Preparation, John Wiley & Sons Ltd., Chichester England. 
18. Wong R.C., Tse H.Y. (2009), Lateral Flow Immunoassay, Springer, Humana Press, New York, USA.