5 phương pháp phát hiện và định lượng vi sinh vật trong thực phẩm

Trường ĐH Dược Hà Nội - Khoa hóa phân tích và kiểm nghiệm thuốc

 Chủ biên GS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu

Các tác giả tham gia biên soạn

PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà

PGS.TS. Lê Thị Hồng Thảo

GS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu

Kiểm tra phân tích vi sinh vật thực phẩm là chỉ tiêu quan trọng trong đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm. Trong bài viết này, Trung Tâm Thuốc Central Pharmacy (trungtamthuoc.com) xin gửi đến bạn đọc các phương pháp phát hiện và định lượng vi sinh vật trong thực phẩm.

1 Phương pháp phát hiện và định lượng vi sinh vật trong thực phẩm

Đánh giá chất lượng an toàn của vi sinh vật thực phẩm không chỉ dừng lại ở việc kiểm tra sự có mặt của vi sinh vật nào đó. Trong nhiều trường hợp, cần phải đưa ra được số lượng các vi sinh vật có mặt trong thực phẩm nên việc định lượng là rất quan trọng. Có nhiều phương pháp để định lượng: phương pháp trực tiếp (dùng kính hiển vi), bằng cách cấy lên môi trường đặc hoặc lỏng, đếm lưu lượng tế bào, phản ứng chuỗi polymerase tức thời... 

Việc lựa chọn phương pháp định lượng vi sinh vật sử dụng môi trường đặc hay lỏng dựa trên nền mẫu và số lượng vi sinh vật có thể có trong mẫu. Phương pháp sử dụng mỗi trường đặc được dựa trên khả năng của nhiều vi sinh vật sinh khuẩn lạc trong hoặc trên môi trường thạch mà có thể phát hiện được bằng mắt thường hoặc bằng kính khuếch đại. Tuy nhiên, nếu các chất nền chứa nhiều chất hạt thì có khả năng gây nhiễu việc phát hiện các khuẩn lạc hoặc mức khuẩn lạc là quá thấp thì không sử dụng được nguyên tắc này mà không qua bước tách trước các vi sinh vật mục tiêu ra khỏi chất nền (ví dụ bằng cách lọc hoặc tách miễn dịch). Trong các trường hợp đó, việc định lượng dùng môi trường lỏng là phương pháp lựa chọn thích hợp. 

Trong phần này sẽ giới thiệu một số phương pháp thường được dùng và một số phương pháp phát hiện nhanh, hiện đại. 

2 Nguyên tắc chung của phương pháp đếm khuẩn lạc 

Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy. Do vậy, các phương pháp sử dụng kỹ thuật này có tên gọi là phương pháp đếm khuẩn lạc hay đếm đĩa. Phương pháp đếm khuẩn lạc hiện bằng kỹ thuật trải hay đổ đĩa với các thiết bị hỗ trợ để đọc kết quả.

Việc pha loãng mẫu cần thực hiện thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có được mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. Mật độ tế bào quá lớn làm các khuẩn lạc chồng chéo lên nhau tạo thành màng sinh khối. Ngược lại, số lượng khuẩn lạc trên một đĩa quá nhỏ sẽ không có giá trị thống kê. Số lượng khuẩn lạc tối ưu theo tiêu chuẩn quốc tế (ISO) là từ 15 - 300 khuẩn lạc/đĩa. 

Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường và điều kiện nuôi. Các tế bào trên đĩa không tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc với tốc độ như nhau, do đó nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc nếu thời gian nuôi không đủ dài. Thông thường, điều kiện nuôi cấy (môi trường, nhiệt độ, thời gian) cần phải đảm bảo sao cho số khuẩn lạc xuất hiện tối đa. Phương pháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai số lớn nên cần thực hiện lặp lại ít nhất hai đĩa. Ngoài ra, do có khả năng nhiều tế bào hình thành chung một khuẩn lạc nên kết quả đếm vi sinh vật trên đĩa thạch được trình bày bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU (colony-forming unit) thay vì số tế bào trong một mililit đối với sản phẩm dạng lỏng (CFU/mL) và hay trong một gam đối với sản phẩm dạng khác (CFU/g). 

Phương pháp đếm khuẩn lạc được tiến hành bởi hai kỹ thuật là: 

• Kỹ thuật đổ đĩa.
• Kỹ thuật dàn bằng que dàn mẫu. 

Mặc dù vẫn còn một số nhược điểm nhưng phương pháp đếm khuẩn lạc vẫn là phương pháp tốt để xác định mật độ tế bào sống. Phương pháp này còn có ưu điểm cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu. 

Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm và bệnh phẩm. 

2.1 Kỹ thuật đổ đĩa 

2.1.1 Yêu cầu chung 

Phương pháp đổ đĩa được dùng để xác định mức vi sinh vật có trong thực phẩm như vi sinh vật hiếu khí. 

Thiết bị, dụng cụ được sử dụng bao gồm: nồi hấp, tủ sấy, máy đo pH, tủ ấm, bể điều nhiệt, pipet, đĩa petri vô trùng. 

Các dung dịch pha loãng phải được chọn sao cho thu được các đĩa chứa một lượng thích hợp các khuẩn lạc và khắc phục được mọi ức chế. 

Sử dụng các pipet vô trùng riêng biệt để chuyển từ mỗi độ pha loãng, ngoại trừ nếu thực hiện từ độ pha loãng cao nhất đến độ pha loãng thấp nhất, 

2.1.2 Pha loãng mẫu 

Hút chính xác 1 mL dung dịch mẫu thử 10^-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 mL nước pepton muối, lắc đều 2 - 3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10^-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo. 

2.1.3 Quy trình đổ đĩa và ủ ấm 

Dùng pipet hoặc đầu côn vô trùng hút 1 mL dịch mẫu dạng lỏng hoặc dạng khác đã được pha loãng cho vào đĩa petri vô trùng. Rót thạch vào đĩa, xoay tròn đĩa 45 độ. Để đông thạch trong 15 phút sau đó mang đi ủ ấm. 

Khi không có quy định nào khác, lật ngược ngay các đĩa đã cấy mẫu và đặt thật nhanh vào tủ ấm đã đặt nhiệt độ thích hợp. Nếu xảy ra sự mất nước nhiều (như ở nhiệt độ 55°C hoặc lưu thông không khí mạnh), gói các đĩa vào các túi chất dẻo trước khi nuôi ấm hoặc sử dụng hệ thống có hiệu quả tương đương. 

Trong suốt quá trình nuôi ấm, kiểm tra nhiệt độ ủ. Dao động của nhiệt độ ủ không thể tránh được và có thể chấp nhận được khi thực hiện các thao tác bình thường trong quá trình như đưa đĩa vào hoặc lấy đĩa ra khỏi tủ ấm. Quan trọng là các quá trình này cần được thực hiện nhanh nhất. Mức dao động này cần được kiểm tra để đảm bảo chúng không ảnh hưởng đáng kể đến kết quả nuôi ấm. 

Nhìn chung, để ủ hiếu khí các đĩa petri không được chồng cao quá 6 đĩa và cần để cách xa nhau và cách xa thành tủ ít nhất là 25 mm. Tuy nhiên, với các tủ ấm có hệ thống tuần hoàn không khí thì có thể chồng cao hơn. Trong trường hợp này, cần kiểm tra sự phân bố nhiệt độ trong tủ. 

2.1.4 Tính và biểu thị kết quả 

Tiếp theo giai đoạn nuôi ấm được hướng dẫn từng phương pháp đối với từng vi khuẩn cụ thể, tiến hành đếm khuẩn lạc (số lượng khuẩn lạc tổng số, số lượng khuẩn lạc điển hình hoặc số lượng khuẩn lạc giả định). Tuy nhiên, tùy thuộc vào nguyên tắc của từng phương pháp đếm đĩa đặc trưng riêng cho từng vi khuẩn khác nhau mà số lượng khuẩn lạc yêu cầu trên mỗi đĩa là khác nhau. Một số phương pháp không yêu cầu phải định dạng khuẩn lạc mà chỉ cần đếm số lượng các khuẩn lạc có trên đĩa, thông thường quá trình phân tích phải đảm bảo chứa ít hơn 300 khuẩn lạc trên một đĩa (như trong phương pháp định lượng vi khuẩn hiếu khí). Trong khi đó một số phương pháp khác yêu cầu tính toán kết quả sau khi đã nhận dạng khuẩn lạc, thông thường quy trình phân tích phải đảm bảo kết quả chỉ chứa ít hơn 150 khuẩn lạc trên một đĩa (như trong phương pháp định lượng Clostridium perfringens). 

Trong trường hợp số đếm trên các đĩa là các số phù hợp theo từng phương pháp thử thì kết quả sau khi tính toán được làm tròn số, chỉ giữ lại hai số có nghĩa. Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10ⁿ (n là số mũ thích hợp của 10), 

Khi đếm các khuẩn lạc điển hình hoặc giả định, việc mô tả các khuẩn lạc phải giống như trong phương pháp cho từng vi sinh vật xác định. 

* Trường hợp 1:  Chọn những đĩa có từ 10 - 300 khuẩn lạc ở các đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp. Tính số khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí cho 1 g (hay 1 mL) sản phẩm (N) bằng cách tính trung bình cộng tổng số có khuẩn lạc của các địa trên theo công thức sau: 

Trong đó: 

N = ΣC / (V x 1,1 x d)

C: số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn. 

V: thể tích dịch cấy trên mỗi đĩa (mL). 

d: hệ số pha loãng của độ pha loãng đã chọn thứ 1. 

* Trường hợp 2: Nếu tổng số khuẩn lạc trên đĩa là từ 1 đến 3, thì độ chụm của kết quả là quá thấp và kết quả phải được ghi lại như sau: 

“Có mặt các vi sinh vật nhưng nhỏ hơn (4 x d) trên gam hoặc mililit”. 

* Trường hợp 3: Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, đánh giá kết quả như sau: 

Ít hơn 1 vi khuẩn hiếu khí trong 1 mL sản phẩm loãng. 

Ít hơn 1/d vi khuẩn hiếu khí trong 1g sản phẩm, trong đó d là hệ số pha loãng của độ pha loãng ban đầu (thường là 10^-1). 

* Trường hợp 4: Nếu số lượng của tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc không điển hình đối với đĩa ở độ pha loãng thứ nhất d1 chứa nhiều hơn 300 (hoặc bất kỳ số lượng khác được nêu trong tiêu chuẩn cụ thể), với số khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc được khẳng định và nếu trên đĩa ở độ pha loãng tiếp theo d2 chứa ít hơn 300 khuẩn lạc (hoặc bất kỳ số lượng khác được nêu trong tiêu chuẩn cụ thể) không điển hình hoặc khuẩn lạc khẳng định cần đếm, thì biểu thị kết quả như sau:

“Ít hơn 1/d2 và nhiều hơn 1/d1 các khuẩn lạc có trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng?" 

hoặc “Ít hơn 1/d2 và nhiều hơn 1/d1 trong một gam (sản phẩm dạng khác)”. 

Trong đó d1 và d2 là các hệ số pha loãng tương ứng với các độ pha loãng d1 và d2.

* Trường hợp 5: Khi số lượng các khuẩn lạc đếm được (khuẩn lạc tổng số, khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc giả định) lớn hơn 300 (hoặc bất kỳ số lượng khác được nêu trong tiêu chuẩn cụ thể) trên đĩa ở độ pha loãng d1, với số khuẩn lạc (khuẩn lạc tổng số, khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc phù hợp với các chuẩn xác nhận) trên đĩa ở độ pha loãng tiếp theo d2 chứa ít hơn 10 khuẩn lạc:

• Nếu số lượng khuẩn lạc trên địa ở độ pha loãng dĩ nằm trong khoảng từ 300 đến 334 (giới hạn trên của khoảng tin cậy đối với giá trị trung bình bằng 300), sử dụng phương pháp tính đối với trường hợp số khuẩn lạc từ 10 - 300. 
• Nếu số lượng khuẩn lạc trên đĩa ở độ pha loãng d1 nhiều hơn 334 (giới hạn trên của khoảng tin cậy đối với giá trị trung bình bằng 300), thì chỉ tính đến kết quả của số đếm của độ pha loãng d2 và thực hiện tiếp với số đếm ước tính, ngoại trừ khi đối chiếu với số tối đa đặt ở 300 để đếm các khuẩn lạc, nếu kết quả ở độ pha loãng d2 ít hơn 8 (giới hạn dưới của khoảng tin cậy đối với giá trị trung bình bằng 10) do chênh lệch giữa hai độ pha loãng là không thể chấp nhận được. 

Các con số tương ứng với khoảng tin cậy cần phải phù hợp với số tối đa được nêu đối với việc đếm khuẩn lạc. 

* Trường hợp 6: Khi số đếm các khuẩn lạc (các khuẩn lạc tổng số, khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc giả định) ở mỗi đĩa đối với tất cả các độ pha loãng đã được cấy tạo ra một lượng lớn hơn 300 (hoặc bất kỳ số lượng khác được nêu trong tiêu chuẩn cụ thể), thì biểu thị kết quả như sau: 

“Nhiều hơn 300/d” (trường hợp các khuẩn lạc tổng số hoặc khuẩn lạc điển hình) hoặc “Nhiều hơn 300 x b/A x 1/d” (trường hợp khuẩn lạc đã khẳng định) vi sinh vật có trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc một gam (sản phẩm dạng khác). 

Trong đó: d là hệ số pha loãng của dung dịch cấy sau cùng. 

b là số lượng khuẩn lạc phù hợp với chuẩn xác nhận hoặc khẳng định trong số các khuẩn lạc giả định đã được cấy A. 

* Trường hợp 7: Khi đĩa chứa độ pha loãng được cấy sau cùng nhiều hơn 10 khuẩn lạc và ít hơn 300 (hoặc bất kỳ số lượng khác được nêu trong tiêu chuẩn cụ thể) khuẩn lạc (khuẩn lạc tổng số, khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc giả định) thì tính số N’ các vi sinh vật có mặt trong mẫu thử là trung bình số khuẩn lạc có trên hai đĩa, sử dụng công thức: 

N’ = c / (V x d)

Trong đó: 

• c: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên đĩa; 
• V: là thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa (mL); 
• d: là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng được giữ lại. 

* Trường hợp 8: Khi phương pháp sử dụng đòi hỏi phải nhận dạng, một lượng A được đem xác định (thông thường là 5) từ các khuẩn lạc giả định đã nuôi cấy trên mỗi đĩa được giữ lại để đếm khuẩn lạc. Sau khi nhận dạng, tính số lượng khuẩn lạc phù hợp trên mỗi đĩa theo các tiêu chí trong công thức sau: 

a = b / A  x C

Trong đó: 

• b: là số khuẩn lạc phù hợp với các tiêu chí xác nhận trong số các khuẩn lạc đã nhận dạng A. 
• C: là tổng số khuẩn lạc giả định đếm được trên đĩa. 

Làm tròn kết quả tính được đến số nguyên gần nhất. 

Tính tổng số vi sinh vật đích cần xác định là N, các vi sinh vật đã nhận dạng hoặc khẳng định có mặt trong mẫu thử, thay ΣC bằng Σa dựa trên công thức sau theo trường hợp 1: 

N = ΣC / (V x 1,1 x d)

2.1.5 Báo cáo kết quả 

Trong báo cáo kết quả kiểm nghiệm phải nêu phương pháp và kết quả tính được số vi sinh vật có trong 1 g hoặc 1 mL sản phẩm kiểm tra. 

Biểu thị kết quả là N vi sinh vật trên mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong 1 gam (sản phẩm dạng khác). 

2.2 Kỹ thuật dàn mẫu bằng que dàn mẫu 

2.2.1 Yêu cầu chung 

Phương pháp dàn mẫu được dùng để xác định mức vi sinh vật có trong thực phẩm như tụ cầu, nấm men và nấm mốc. 

Thiết bị, dụng cụ được sử dụng bao gồm: nồi hấp, tủ sấy, máy đo pH, tủ ấm, bể điều nhiệt, pipet, đĩa petri vô trùng, que dàn mẫu vô trùng. 

Các dung dịch pha loãng phải được chọn sao cho thu được các đĩa chứa một lượng thích hợp các khuẩn lạc (không quá 150 khuẩn lạc) và khắc phục được mọi ức chế. 

Sử dụng các pipet vô trùng riêng biệt để chuyển từ mỗi độ pha loãng, ngoại trừ nếu thực hiện từ độ pha loãng cao nhất đến độ pha loãng thấp nhất. 

2.2.2 Pha loãng mẫu 

Hút chính xác 1 mL dung dịch mẫu thử 10^-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 mL nước pepton muối, lắc đều 2 - 3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10^-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo. 

2.2.3 Quy trình tiến hành chuyển mẫu lên môi trường và dàn mẫu 

Dùng pipet vô trùng, chuyển 0,1 mL dịch cấy (hoặc 0,5 mL) mẫu thử dạng lỏng hoặc huyền phù ban đầu (nếu sản phẩm ở dạng khác) vào đĩa thạch (đường kính tượng ứng 90 mm hoặc 140 mm). Lặp lại bước này cho dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo (các khuẩn lạc cần đếm sẽ có mặt trong dung dịch 10^-1 trong trường hợp mẫu ở dạng lỏng và dung dịch 10^-2 trong trường hợp mẫu ở dạng khác) và nếu cần lặp lại với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo. 

Trong trường hợp các sản phẩm cần phát hiện có ít vi khuẩn, giới hạn phát hiện có thể tăng lên 10 lần bằng cách phân tích 1,0 mL mẫu đối với sản phẩm ở dạng lỏng và 1,0 ml huyền phù ban đầu đối với các sản phẩm ở dạng khác. Khi đó, dàn đều 1,0 mL dịch cấy lên khắp bề mặt của một đĩa petri cỡ lớn (đường kính 140 mm) hoặc ba đĩa petri cỡ nhỏ (đường kính 90 mm). 

Dùng que dàn mẫu dàn dịch cấy càng nhanh càng tốt trên khắp bề mặt thạch mà không chạm vào thành của đĩa petri. Đậy nắp đĩa và để cho dịch cấy hấp thụ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Que dàn mẫu có thể làm bằng thủy tinh (chất dẻo hoặc thép) và được tạo hình giống như gậy đánh hockey đường kính khoảng 3,5 mm và dài 20 cm, một đầu được uốn cong một đoạn dài khoảng 3 cm và được làm dẹt ở đầu cuối. 

2.2.4 Tính và biểu thị kết quả 

• Trong trường hợp phương pháp chỉ yêu cầu đếm vi sinh vật mọc trên đĩa thạch thì cách tính và biểu thị kết quả tương tự với cách tính kết quả đã được trình bày trong kỹ thuật đổ đĩa (trường hợp 1 đến trường hợp 7). 
• Trong trường hợp phương pháp sử dụng đòi hỏi phải nhận dạng vi khuẩn thì cách tính và biểu thị kết quả như trường hợp 8 đã trình bày trong kỹ thuật đổ đĩa. 

2.2.5 Báo cáo kết quả 

Trong báo cáo kết quả kiểm nghiệm phải nêu phương pháp và kết quả tính được số vi sinh vật có trong 1 g hoặc 1 mL sản phẩm kiểm tra. 

3 Phương pháp MPN 

3.1 Nguyên tắc của phương pháp 

Phương pháp MPN (Most Probable Number, phương pháp có số xác suất lớn nhất, số tối khả). Phương pháp này còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số mẫu. Phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (dãy 3 ống), có tổng cộng 9 ống nghiệm (3 x 3) hoặc thực hiện lặp lại mỗi nồng độ 5 ống nghiệm ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (dãy 5 ống), tổng cộng 15 ống nghiệm. 

Các phần mẫu thử được cấy vào môi trường lỏng để hỗ trợ cho sự phát triển các vi sinh vật đặc trưng (hoặc nhóm vi sinh vật) và thường ức chế sự tăng nhanh các vi sinh vật không phải mục tiêu. 

Quy trình thực hiện định lượng theo phương pháp này như sau: Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần kiểm định một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (ví dụ 10^-1, 10^-2, 10^-3). Ủ các ống có chứa vi sinh vật ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. 

Dựa vào kết quả cho thấy sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm thông qua các hiện tượng như sinh hơi, đổi màu, đục... trên môi trường chọn lọc. Thành phần của môi trường và tiêu chí phân biệt giữa kết quả âm tính và dương tính được xác định trong các phương pháp tương ứng với từng loại vi sinh vật khác nhau. Ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này là dựa vào bảng Mac Crady mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/1 mL đổi với sản phẩm dạng lỏng hoặc MPN/1 g đối với sản phẩm dạng khác. Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng: số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của trị số MPN càng lớn. 

Phương pháp MPN có thể dùng để định lượng mọi nhóm vi sinh vật có thể được nuôi cấy trong môi trường lỏng chọn lọc và cho kết quả thích hợp. Ví dụ sử dụng môi trường mật Lactose lục sáng ở 37°C có thể định lượng nhóm coliform hoặc cho phép định lượng E. coli giả định có trong thực phẩm ở 44°C trong môi trường lỏng EC, Phương pháp định lượng hai nhóm vi khuẩn này sẽ được trình bày chi tiết trong các phần sau. 

Trong quá trình phân tích mẫu được pha loãng ở các nồng độ thập phân khác nhau như 10^-1, 10^-2 và 10^-3. Lượng mẫu với các độ pha loãng này tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo Bảng MNP/100 mL tỉnh theo lượng mẫu là 10 mL, 1 mL, 0,1 ml nếu trên. Trường hợp mật độ vi sinh vật quá cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng tiếp theo cần phải nhân trị số tra theo Bảng MPN với hệ số pha loãng. Ví dụ sử dụng 1 mL cho mỗi độ pha loãng 10^-2, 10^-3 và 10^-4 tức là chỉ sử dụng 1/10 lượng mẫu ở mỗi nồng độ so với trường hợp dùng 1 mL mẫu ở các độ pha loãng 10^-1, 10^-2 và 10^-3. Do đó, chỉ số tra theo bảng MPN nêu trên cần được nhân thêm hệ số pha loãng là 10. 

Với cách tiếp cận này, giá trị định lượng có thể quy cho từng phần mẫu thử với kết quả là dương tính hoặc âm tính. Để thu được số ước lượng vi sinh vật có mặt, thi cẫn kiểm tra vài phần mẫu thử và sử dụng quy trình thống kê để xác định số có xác suất lớn nhất và tra Bảng MPN. 

3.2 Chuẩn bị mẫu thử và pha loãng 

Cân chính xác một lượng mẫu thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút một thể tích thực phẩm lỏng) cho vào bình nón có chứa gấp 9 lần khối lượng mẫu đã cân thể tích nước pepton muối, lắc đều 2 - 3 phút để thu được dung dịch mẫu thử 10-1. 

Hút chính xác 1 mL dung dịch mẫu thử 10' cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 mLnước pepton muối, lắc đều 2 - 3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch mẫu thử 10-3. 

3.3 Cách tiến hành 

Định tính

Lấy x mL mẫu thử dạng lỏng (hoặc huyền phù ban đầu nếu mẫu thử ở dạng khác). chuyển vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép khi 1 mL < x < 10 mL hoặc vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn khi x ≤ ImL 

Định lượng 

Dùng pipet vô trùng chuyển 10 mL mẫu thử dạng lỏng hoặc 10 mL huyền phù bạn đầu nếu mẫu thư ở dạng khác vào ống nghiệm chứa 10 mL môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép, lặp lại ba lần. Hoặc dùng pipet vô trùng chuyển 1 mL mẫu thử dạng lỏng hoặc 1 mL huyền phù ban đầu nếu mẫu thử ở dạng khác vào ống nghiệm chứa 10 mL môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn, lặp lại ba lần với hệ ba dãy ống. 

Bảng 1: Chỉ số MPN và giới hạn tin cậy (95%) khi sử dụng ba phần mẫu thử 1 g (mL), ba phần mẫu thử 0,1 g (mL) và ba phần mẫu thử 0,01 g (mL)

Đối với mỗi độ pha loãng tiếp theo, thực hiện tương tự bước trên. Sử dụng mỗi pipet vô trùng cho mỗi độ pha loãng. Trộn kỹ dịch cấy với môi trường. 

3.4 Tính và biểu thị kết quả 

Dựa vào số các ống dương tính chỉ rõ sự có mặt hay không có mặt coliform trong phần mẫu thử x g hoặc x mL của sản phẩm. Xem bảng MPN để xác định tổng số vi sinh vật đích. 

Tính số có xác suất lớn nhất từ số ống dương tính đối với mỗi độ pha loãng (xem bảng MPN). 

4 Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh 

4.1 Nguyên tắc 

Phân tử adenosin triphosphat (ATP) hiện diện trong tất cả các tế bào thuộc sinh vật đa bào và đơn bào nên sự phát hiện ATP là dấu hiệu để nhận biết vật chất sống đang tồn tại. ATP có thể được phát hiện một cách nhanh chóng bởi lượng ánh sáng phát ra thông qua sự kết hợp với enzym luciferase nhờ một máy đo ánh sáng. Kỹ thuật này có thể phải hiện được 1pg ATP (10-12g), tương đương với khoảng 1000 tế bào vi khuẩn (10-15g ATP/ bào). Độ nhạy này có được khi sử dụng với những hóa chất thương mại. Sự phân tích sẽ diễn ra chỉ trong vài phút, vì vậy phương pháp này được xem là nhanh hơn và thuận tiện hơn so với phương pháp đếm khuẩn lạc. 

Việc dùng phương pháp đo hàm lượng ATP để xác định rõ số lượng vi sinh vật đang hiện diện đã được biết đến vào năm 1960. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi nhiều su cải tiến trong việc thiết kế máy đo lượng ánh sáng phát ra như giảm chi phí sản xuất và gọn nhẹ để có thể tiến hành tại hiện trường. Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở ATP của vi sinh vật cần phải được tách ra khỏi tế bào vi sinh vật và được định lượng dựa vào cường độ ánh sáng phát ra. 

Ngày nay sự phát quang sinh học đã được sử dụng khá rộng rãi để đánh giá chất lượng vệ sinh bề mặt thiết bị sử dụng trong quá trình sản xuất, chế biến, đánh giá chất lượng thực phẩm, mỹ phẩm. Quy trình thực hiện rất đơn giản, cho kết quả rất nhanh chóng trong vài phút và có thể dễ dàng tự động hóa. Nguyên tắc chung của quy trình này như sau: mẫu được thu bằng cách dùng que bông vô trùng quẹt một diện tích nhất định trên bề mặt dụng cụ, thiết bị. Sau đó, que bông được cho vào dung dịch tách chiết ATP, xử lý với ATPase và cho phản ứng phát sáng. Gần đây nhiều hệ thống phát hiện được thiết kế, chế tạo chứa sẵn những hóa chất nằm trong dụng cụ quét mẫu bằng tay. 

4.2 Ứng dụng của phương pháp phát quang sinh học ATP 

Tình trạng vệ sinh bề mặt thiết bị trong sản xuất, chế biến thực phẩm và tổng vi khuẩn hiếu khí trong thành phẩm được xác định bằng tổng lượng ATP của mẫu. Tổng hàm lượng ATP này bao gồm hàm lượng nhân thật và ATP của tế bào vi sinh vật. Thông thường, ATP không có nguồn gốc là tế bào vi sinh vật thì được tách chiết bởi những chất tẩy không ion như triton X-100. ATP này sau khi được tách khỏi tế bào sẽ được thủy phân bằng cách xử lý với enzym ATPase trong vòng 5 phút. Tiếp theo ATP của tế bào vi sinh vật sẽ được chiết sang tricloracetic (5%). Ánh sáng phát ra bởi phản ứng phát sáng được đo bằng các loại máy đo ánh sáng đo được cường độ ánh sáng thấp.

5 Phương pháp ELISA 

5.1 Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch

Phương pháp miễn dịch ELISA (Enzyme - Linked ImmunoSorbent Assay) là phản ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng nguyễn) với một kháng thể đặc hiệu. Tín hiệu của phản ứng miễn dịch có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên - kháng thể hoặc bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu (bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzym). 

Trong số các phương pháp phân tích miễn dịch, phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzym (Enzyme linked immunosorbent assay - ELISA hay emzyme immunosorbent assay - EIA) được quan tâm nhiều do có tính đơn giản và hiệu quả cao. Phản ứng ELISA được thực hiện dựa trên kỹ thuật “sandwich”. Phương pháp này có thể sử dụng hầu hết cho các kháng nguyên với độ nhạy và đặc hiệu cao. Kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng phủ vào đĩa giếng (microplate). Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzym như horseradish Peroxidase hay alkaline phosphatase. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzym vào giếng, enzym xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên. 

ELISA có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh. Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 10 CFU/mL. Tuy nhiên trong phương pháp này vẫn cần thực hiện bước tăng sinh và tăng sinh chọn lọc trước khi thực hiện các phản ứng miễn dịch.

5.2 Ứng dụng của phương pháp miễn dịch ELISA 

Phương pháp ELISA cho phép phát hiện độc tố đường ruột và định danh độc tố (loại A đến E) của Staphylococci trong thực phẩm. Quy trình này có thời gian ngắn 4 giờ, có độ nhạy cao (1 mg/mL hay mg) và có thể phát hiện đồng thời sự hiện diện của nhiều loại độc tố của Staphylococcus nhưng không thể phân biệt được các loại độc tố. 

6 Phương pháp lai phân tử 

6.1 Nguyên tắc của phương pháp 

Từ những năm 1980, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm ứng dụng các thành tựu của kỹ thuật di truyền sinh học phân tử vào lĩnh vực thực phẩm. Hiện nay nhiều hệ thống được phát triển nhằm định lượng vi sinh vật và độc tố. Tuy nhiên, chỉ có phương pháp lai phân tử (Hybridization) hay còn được gọi là phương pháp mẫu dò (probes), phương pháp PCR (polymerase chain reaction) được thương mại hóa dưới dạng các bộ kít phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Phương pháp sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là quá trình lai phân tử. Quá trình này bao gồm sự tách rời hai mạch đơn của chuỗi xoắn kép ADN khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử ADN và sự tái bắt cặp giữa các đoạn ADN trình tự nucleotid bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Một trong hai mạch ADN bổ sung (gọi là ADN tiêu là ADN của tế bào vi sinh vật) được cố định trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên tế bào hay mô. Sự lai phân tử xảy ra khi toàn bộ trình tự nucleotid bổ sung gặp vùng trình tự trên ADN mục tiêu do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn nhiệt độ Tm ít nhất vài độ. Sự lai phân tử còn có thể xảy ra giữa ADN và ARN. Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố: nồng độ trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường. Hệ thống này sử dụng que thử với mẫu dò để phát hiện Listeria trong mẫu bơ sữa và mẫu môi trường. Mẫu do là những đoạn oligomer ADN đánh dấu bằng hóa chất phát quang. Quy trình phẫn tích có thể được chia thành sáu bước: 

• Phá vỡ tế bào thu nhận rARN.  
• Mẫu dò ADN có đuôi oligodeoxyadenylic nucleotid (dA) và mẫu dò phát hiện (reporter probe) chứa fluorescein isothiocyanat (F) ở đầu 5’ và 3’ của phân tử được đặt vào phản ứng. 
• Que thử được bao bọc bởi polydeoxythymidin (dT) để gắn được với oligodA của mẫu dò
• Que thử được đặt vào ống đo chứa mẫu dò phát hiện được đánh giá đánh dấu bằng enzym. 
• Sau khi rửa lại phần enzym thừa, que thử được đặt vào ống đo chứa cơ chất tạo màu. 
• Sau khi ủ để hiện màu, màu được phát hiện ở bước sóng 450 nm. 

6.2 Ứng dụng của phương pháp lai phân tử 

• Phát hiện nhanh các vi khuẩn E. coli gây bệnh. 
• Là cơ sở tạo nên các kit phát hiện nhanh vi sinh vật có trong thực phẩm như Salmonella, Listeria monocytogenes, dòng tụ cầu kháng kháng sinh mạnh. 

7 Tài liệu tham khảo

1. Thái Nguyễn Hùng Thu, Phạm Thị Thanh Hà, Lê Thị Hồng Hảo (2023), "Kỹ thuật phân tích vi sinh thực phẩm", Kiểm Nghiệm Thực Phẩm. Nhà xuất bản Y học, trang 101 - 128. Tải bản PDF tại đây.
2. Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
3. Trần Đáng (2004), Mối nguy vệ sinh an toàn thực phẩm - Chương trình kiểm soát GMP, GHP và hệ thống quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm HACCP, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 
4. Nguyễn Công Khẩn, Hà Thị Anh Đào (2007), Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam Vietnamese Food Composition Table, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 
5. Nguyễn Công Khẩn (2008), Dinh dưỡng cộng đồng và an toàn vệ sinh thực phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục. 
6. Hà Duyên Tư (2009), Phân tích hóa học thực phẩm, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội. 
7. Codex Alimentarius International Food Standards, General Standard for Food Additives Codex Stan 192 - 1995, revision 2014. 
8. Emerton V., Choi E. (2008), Essential Guide to Food Additives, Letherhead Publishing, Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK. 
9. Hurst W.J. (2008), Methods of Analysis for Functional Foods And Nutraceuticals, CRC Press, Taylor and Francis Group, Florida, USA. 
10. James M. Jay (1996). Modern food Microbiology. 5 th edition. CBS publishers and distributors, Dehli, India.
11. Lightfoot N.F., Maier E.A. (1998), Microbiological Analysis of Food and Water, Elsevier Science B.V., Asmterdam, The Netherlands. 
12. Marwaha K. (2010), Control and Analysis For Food and Agricultural Products, Gene-Tech Books, New Dehli, India. 
13. Newton D.E. (2007), Food Chemistry, Library of Congress, Infobase Publishing, New York. 
14. Nielsen S.S. (2010), Food Analysis, 4th Edition (Food Science Texts Series), Springer, London, England. 
15. Nollet L.M.L. (2009), Fidel Toldra Handbook of Dairy Foods Analysis, CRC Press, Taylor and Francis Group, Florida, USA. 
16. Nollet L.M.L. (2010), Fidel Toldra Safety Analysis of Foods of Animal Origin, CRC Press, Taylor and Francis Group, Florida, USA.
17. Rita Cornelis, Caruso J.A., Crews H., Heumann K.G. (2003), Handbook of Elemental Speciation: Techniques and Methodology, Chapter II. Techniques and Methodology for Sample Preparation, John Wiley & Sons Ltd., Chichester England. 
18. Wong R.C., Tse H.Y. (2009), Lateral Flow Immunoassay, Springer, Humana Press, New York, USA.