Nguyên lý nhuộm tế bào và một số chất nhuộm DNA, RNA ngoài tế bào

Trường Đại Học Y Hà Nội - Bộ môn Khoa học xét nghiệm

Chủ biên PGS.TS.BS Đặng Thị Ngọc Dung, TS. Nguyễn Trọng Tuệ

Các tác giả tham gia biên soạn

PGS. TS. BS Đặng Thị Ngọc Dung, TS. Nguyễn Trọng Tuệ, TS. BS. Nguyễn Thúy Hương, TS. BS. Nguyễn Thị Thanh Hải

ThS. Đặng Quang Huy, Ths. BSNT. Nguyễn Quỳnh Giao, Ths. BSNT. Vũ Đức Anh, ThS. Trịnh Thị Phương Dung

Ths. BSNT. Lê Văn Toàn, Ths. BSNT. Ngô Diệu Hoa, BSNT. Phạm Thị Hương Trang, Ths. BSNT. Nguyễn Thị Thu Thảo

Ths. BS. Nguyễn Thị Hảo, CKI. Đỗ Thị Hường, CKI. Nguyễn Thúy Hà, ThS. Vũ Thị Bích Hồng

CN. Lê Thanh Thảo, CN. Nguyễn Hữu Hùng

Các mô, tế bào, hoặc các thành phần cơ quan nhỏ hơn thường không có màu hoặc rất khó phân biệt bằng màu sắc tự nhiên. Nhuộm các thành phần này với các thuốc nhuộm màu khác nhau, có ái lực đặc hiệu cho từng thành phần của các mô giúp chúng ta dễ dàng quan sát được hình thái của chúng. Từ đó giúp hỗ trợ tìm căn nguyên gây bệnh. Trong bài viết này, Trung Tâm Thuốc Central Pharmacy (trungtamthuoc.com) xin gửi đến bạn đọc thông tin về kỹ thuật nhuộm.

1 Một số khái niệm chung 

1.1 Thuốc nhuộm 

Là các hợp chất được sử dụng trong nhuộm màu, thường là chất hữu cơ, có thể gồm một chất hoặc một nhóm chất có khả năng nhuộm màu một cách bền vững. Thuốc nhuộm cần có 2 nhóm cấu trúc phân tử đặc biệt: Nhóm phân tử có tác dụng tạo màu, còn được gọi là nhóm mang màu (chromophore). Nhóm phân tử có khả năng giữ (cố định) màu một cách bền vững tại mô hoặc tế bào được nhuộm. Nhóm này có khả năng tạo muối và còn được gọi là nhóm định màu (auxochrome). 

1.2 Ưa kiềm (basophilic) 

Các chất được nhuộm bằng thuốc nhuộm kiềm tính. 

1.3 Ưa acid (acidophilic) 

Các chất được nhuộm bởi thuốc nhuộm acid. 

1.4 Nhuộm tươi (Vital staining) 

Là phương pháp nhuộm màu cấu trúc trên các tế bào sống cũng như trong cơ thể (in vivo) hoặc các mẫu xử lý trong trong phòng thí nghiệm (in vitro). ví dụ chất nhuộm Janus Green B đã được sử dụng trong kỹ thuật nhuộm để xác định mật độ tế bào, phát hiện sự hiện diện của telocytes trong khí quản và phổi và được sử dụng làm thuốc nhuộm để mô phỏng các ống dẫn bonghan bên trong mạch bạch huyết của thỏ. 

1.5 Nhuộm dị sắc (Metachromatic staining) 

Có một số thuốc nhuộm cơ bản thuộc nhóm anilin sẽ phân biệt các thành phần mô đặc trưng bằng cách nhuộm chúng bởi các màu khác với thuốc nhuộm ban đầu. Hiện tượng này được gọi là dị sắc. Phần tử mô phản ứng theo cách này được gọi là biểu hiện dị sắc. 

1.6 Nhuộm trực tiếp 

Ứng dụng thuốc nhuộm đơn giản để nhuộm mô với các sắc thái màu khác nhau. 

1.7 Nhuộm gián tiếp 

Là sử dụng chất kết dính tạo điều kiện cho một phương pháp nhuộm cụ thể hoặc sử dụng chất tạo màu để cải thiện mức độ chọn lọc hoặc tăng cường cho chất nhuộm. 1.8. Nhuộm tiến triển (Progressive staining) 

Thuốc nhuộm được cho lên mô theo trình tự nghiêm ngặt và trong thời gian cụ thể. Thuốc nhuộm không bị rửa hoặc tẩy đi và quá trình nhuộm màu được kiểm soát liên tục dưới kính hiển vi. 

1.8 Nhuộm thoái triển (Regressive staining) 

Ngược lại với nhuộm màu tiến triển, đầu tiên, mô được nhuộm quá mức và sau đó vết dư thừa được loại bỏ dần trên toàn bộ phần mô nhuộm cho đến khi chỉ còn lại các cấu trúc cần nhuộm bắt màu rõ ràng. Quá trình này được gọi là sự khác biệt và luôn phải được kiểm soát dưới kính hiển vi. Sự khác biệt nằm ở bước rửa sạch vết bẩn hoặc thuốc nhuộm dư thừa cho đến khi màu sắc chỉ thu được trong các thành phần mô cần nghiên cứu. 

1.9 Khử màu 

Là sự loại bỏ một phần hoặc toàn bộ chất nhuộm khỏi các phần mô. Khi màu được loại bỏ một cách chọn lọc (thường là với sự kiểm soát bằng kính hiển vi) thì nó được gọi là sự khác biệt hoá. Một số trường hợp khử màu nhằm lựa chọn giữ lại thành phần nhuộm mong muốn và loại bỏ các vết nhuộm khác không cần thiết. 

1.10 Ngâm tẩm (Impregnation) 

Là sự lắng đọng muối của kim loại nặng trên hoặc xung quanh tế bào, các thành phần cấu tạo mô, v.v. Nó có các đặc điểm sau: 

• Các cấu trúc thể hiện mờ đục và đen. 
• Chất màu là dạng hạt. 
• Các chất bắt màu nằm trên hoặc xung quanh chứ không nằm bên trong

1.11 Nhuộm hóa mô (Histochemical staining) 

Là phương pháp nhuộm được sử dụng để chỉ ra thành phần hóa học của mô hoặc các yếu tố tế bào. 

1.12 Chất liên kết, chất cầm màu (Mordants) 

Là chất tạo ra phản ứng tạo màu nhờ hình thành liên kết thuốc nhuộm với mô, cơ quan 

2 Một số loại thuốc nhuộm thường dùng

Thuốc nhuộm được phân loại theo nhiều cách khác nhau: 

• Dựa trên nguồn gốc: có thể chia thành hai loại là thuốc tự nhiên và thuốc tổng hợp, thuốc nhuộm tổng hợp có phổ màu lớn hơn thuốc nhuộm có nguồn gốc tự nhiên.  
• Dựa vào ái lực của thuốc với mô: có Thiazin và Rosailin. 
• Dựa vào thành phần hóa học: có ưa acid và ưa kiềm. 

2.1 Thuốc nhuộm có nguồn gốc tự nhiên 

Loại thuốc này không đa dạng về chủng loại, chủ yếu được sử dụng với hai loại chính sau: 

• Haemotoxylin: Đây là loại thuốc nhuộm phổ biến nhất được sử dụng làm chất nhuộm nhân. Nó có nguồn gốc từ cây dài được tìm thấy ở Mexico. Màu được phát triển sau quá trình oxy hóa. Đây là một loại thuốc nhuộm cho màu yếu và để tăng màu sắc rõ nét hơn thì cần phải có chất tăng cường màu. 
• Carmine: Là một loại thuốc nhuộm màu đỏ tươi được làm từ thân dưới của bọ cánh cứng. 

2.2 Thuốc nhuộm tổng hợp 

Hầu hết thuốc nhuộm tổng hợp đều có trong gốc anilin và có nguồn gốc từ Nhựa than đá. Những thuốc nhuộm anilin này cung cấp nhiều màu sắc và nhiều hoạt tính hơn so với thuốc tự nhiên. Thành phần hóa học có thể là base, acid, lưỡng tính (trung tính). Theo các đặc tính này, chất nhuộm tổng hợp có thể nhuộm được các thành phần khác nhau của mô nên ứng dụng rộng rãi hơn. 

2.2.1 Thuốc nhuộm có tính kiềm 

Đây là thuốc nhuộm cation và nhuộm nhân, hạt ưa base hoặc tế bào vi khuẩn.

2.2.2 Thuốc nhuộm có tính acid 

Đây là những thuốc nhuộm anion và nhuộm màu chủ yếu là tế bào chất, bạch cầu ái toan. 

3 Cơ sở lý thuyết

Các phương pháp nhuộm đều dựa trên một số đặc tính vật lý như: 

• Tính tan: Các chất nhuộm có khả năng hoà tan trong chất béo hoặc nước. Do vậy, chúng có thể thấm vào trong các tế bào, mô, cơ quan. 
• Tính hấp thụ: Đây là đặc tính mà một vật thể lớn tự hút các hạt nhỏ từ môi trường xung quanh về mình. Các chất nhuộm màu có phân tử nhỏ, sẽ bị hấp thụ vào các mô hay tế bào. 

Ngoài ra, phương pháp nhuộm còn dựa trên các đặc tính hóa học; theo các liên kết tương tác giữa thuốc nhuộm và mẫu. 

Thuốc nhuộm có tính acid sẽ được dùng để nhuộm các nguyên tố có tính kiềm (như tế bào chất) và ngược lại, thuốc nhuộm kiềm tính sẽ được dùng để nhuộm các vật liệu ưa acid (như nhân tế bào). 

Tuy nhiên, trên thực tế, điều này không hoàn toàn như vậy. Ví dụ hematoxylin, là một loại thuốc nhuộm acid, nhưng lại không nhuộm tế bào chất. Khi có mặt chất hỗ trợ, nó lại trở thành một trong những chất phổ biến nhất dùng trong nhuộm nhân. 

4 Các kỹ thuật nhuộm tế bào

4.1 Nhuộm tế bào 

Nhuộm tế bào là một kỹ thuật có thể được sử dụng để phân tích hình thái tế bào và các thành phần trong tế bào dưới kính hiển vi. Bằng cách sử dụng các chất nhuộm khác nhau, người ta có thể ưu tiên nhuộm các thành phần tế bào theo mong muốn (ví dụ như chỉ nhuộm nhân hoặc thành tế bào, hoặc toàn bộ tế bào). Hầu hết các kỹ thuật nhuộm sử dụng tế bào đã được cố định hoặc tế bào chết, trong khi chỉ một số kỹ thuật nhuộm được sử dụng trên các tế bào sống. Ngoài ra có một số kỹ thuật nhuộm có thể được sử dụng trên cả hai loại tế bào. 

Các tế bào sau khi nhuộm màu sẽ giúp tăng khả năng quan sát hình ảnh cấu trúc bên ngoài cũng như các thành phần bên trong tế bào dưới kính hiển vi. Việc nhuộm tế bào cũng cho thấy quá trình trao đổi chất hoặc để phân biệt giữa tế bào sống và tế bào chết trong mẫu. Bên cạnh đó, nhuộm và đếm tế bào cũng giúp chúng ta xác định sinh khối trong môi trường nuôi cấy. Như vậy kỹ thuật nhuộm tế bào là một trong những kỹ thuật cơ bản giúp xác định số lượng, hình thái và sự thay đổi các thành phần cấu trúc, từ đó phát hiện được những bất thường xảy ra ở mức độ tế bào. 

Kỹ thuật nhuộm tế bào bao gồm các bước cơ bản sau: 

4.1.1 Xử lý tế bào 

Sử dụng các chất hoạt động bề mặt nhẹ, làm tan màng tế bào để cho phép các phân tử thuốc nhuộm lớn hơn đi vào bên trong tế bào. 

4.1.2 Cố định 

Hỗ trợ cho việc sửa chữa hoặc bảo tồn hình thái tế bào hoặc mô thông qua quá trình chuẩn bị. Quá trình này có thể bao gồm một số bước, nhưng hầu hết các quy trình cố định đều liên quan đến việc thêm chất cố định nhằm mục đích tạo ra liên kết hóa học giữa các protein để tăng độ cứng của thế bào. Các chất cố định phổ biến bao gồm formaldehyde, ethanol, methanol và/hoặc acid picric. 

4.1.3 Gắn tế bào lên lam kính 

Gắn các mẫu vào một lam kính hiển vi để quan sát và phân tích. Các tế bào có thể được nuôi cấy trực tiếp lên phiến kính hoặc nhỏ tế bào vào phiến kính và thực hiện việc phân tích dưới kính hiển vi. 

4.1.4 Nhuộm 

• Đưa thuốc nhuộm vào mẫu để tạo màu cho tế bào, mô, thành phần tế bào hoặc quá trình trao đổi chất. Có thể nhỏ thuốc nhuộm lên hoặc nhúng mẫu vào dung dịch thuốc nhuộm, mẫu có thể là trước hoặc sau khi cố định tuỳ thuộc vào mục đích. Một số thuốc nhuộm yêu cầu sử dụng chất hỗ trợ để lên màu. 
• Rửa: Sau khi đủ thời gian nhuộm, mẫu sẽ được đem đi rửa, làm trôi sạch các chất nhuộm dư hoặc không bám vào tế bào. 
• Phân tích: Tiêu bản sau nhuộm sẽ được phân tích dưới kính hiển vi với độ phóng đại phù hợp. 

Có nhiều loại thuốc nhuộm, mỗi loại có thể được sử dụng cho một mục đích khác nhau. Trong đó, có thể kể đến một số loại thuốc nhuộm tế bào phổ biến như: 

• Bismarck Brown: đây là một loại protein, màu vàng và có thể được sử dụng để nhuộm tế bào sống. 
• Tím pha lê: nhuộm thành màu tím của tế bào khi kết hợp với chất hỗ trợ màu. Thường được sử dụng trong nhuộm Gram. 
• DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole): một thuốc nhuộm huỳnh quang có khả năng gắn vào vùng giàu Adenin và Thymin trên sợi đôi của phân tử DNA và phát ra huỳnh quang màu xanh lam khi bị kích thích bởi ánh sáng cực tím. DAPI có thể được sử dụng trong các tế bào sống hoặc cố định và thường được sử dụng để nhuộm nhân tế bào. 
• Ethidium bromide - chất nhuộm màu huỳnh quang có màu đỏ cam, thường được sử dụng để phát hiện các tế bào không khỏe mạnh trong giai đoạn cuối của quá trình apoptosis, hoặc chết tế bào có chủ ý. 
• Hematoxylin - một chất nhuộm màu có nguồn gốc từ thiên nhiên, được chiết xuất từ lõi thân cây Hematoxylon Campechianum. Ở dạng thô, Hematoxylin không có tác dụng nhuộm màu. Tuy nhiên khi được oxy hóa Hematoxylin (C6H1406) bị mất 2 nguyên tử Hydrogen trở thành chất hoạt hóa Hematein (C6H12O6) có khả năng bắt màu nhân tế bào, làm cho hạt nhân có màu xanh tím hoặc nâu. 
• Eosin - là muối Sodium (natri) của acid màu, thường được sử dụng kết hợp với Hematoxylin. Có 2 loại Eosin là Eosin Y và Eosin B. Trong đó, Eosin Y được sử dụng rộng rãi và phổ biến hơn để nhuộm tế bào hồng cầu, màng tế bào, tế bào chất và một số cấu trúc ngoại bào. Các loại tế bào này có thể bắt màu hồng hoặc đỏ. 
• Fuchsin - được sử dụng để nhuộm Collagen, cơ trơn hoặc ti thể. 

Một số hạn chế của phương pháp nhuộm tế bào: 

• Một số tế bào có kích thước nhỏ có thể khó phân tích, ngay cả với kính hiển vi. Các tế bào này có thể bị bỏ qua hoặc ẩn sau các thành phần khác trong mẫu. 
• Khó định lượng bằng cách đếm số lượng tế bào khi mật độ tế bào cao trong mẫu. Điều này có thể khắc phục bằng cách pha loãng mẫu nhưng việc đếm thủ công cũng có thể dẫn đến nhiều sai số. 
• Có thể khó xác định và định lượng tế bào khi giữa các tế bào có sự tương tác gắn kết với nhau hoặc gắn với chất nền, do đó, khó phân biệt các tế bào riêng lẻ. 
• Có thể khó phân biệt giữa tế bào chết và tế bào sống trong mẫu vật. 

5 Nhuộm nhiễm sắc thể 

Mỗi tế bào của con người có 46 nhiễm sắc thể, bao gồm 22 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể quy định giới tính. Những nhiễm sắc thể này chứa thông tin di truyền của tế bào, là nguyên vật liệu di truyền để một cá thể phát triển bình thường. Do đó, các bất thường ở mức độ nhiễm sắc thể như mất đoạn, thêm đoạn và lặp đoạn có thể gây ra tình trạng bệnh lý, thậm chí có thể dẫn tới tử vong ở giai đoạn sớm của quá trình phát triển phôi thai. 

Nhiễm sắc thể là cấu trúc cô đặc bao gồm các phân tử deoxyribose nucleic acid (DNA). Nhiễm sắc thể phân bố ở trong nhân tế bào – một bào quan có tổ chức rõ ràng từ màng nhân, chất nhân đến các đơn vị cơ bản như nucleosome. Quá trình đóng gói DNA trong nhiễm sắc thể bao gồm nhiều bước trong của quá trình phân bào. Để nghiên cứu và phân tích nhiễm sắc thể, phương pháp đơn giản và thông dụng nhất là phương pháp nhuộm. Nhiễm sắc thể dưới kính hiển vi sau khi nhuộm có thể quan sát thấy các vùng hay còn gọi là các băng khác nhau; có băng bắt màu đậm, có băng bắt màu nhạt. Các băng bắt màu đậm là vùng có DNA dày đặc được đóng gói trong cấu trúc dị nhiễm sắc (heterochromatin). Các băng nhuộm màu nhạt là vùng có DNA được đóng gói lỏng lẻo được gọi là vùng nhiễm sắc thực (Euchromatin). Dị nhiễm sắc có thể gồm hai dạng là dị nhiễm sắc bảo thủ (Constitutive heterochromatin) và dị nhiễm sắc bất ổn. Chúng có thể là các vùng đặc bắt màu sẫm của DNA được tìm thấy trên khắp nhiễm sắc thể của sinh vật nhân chuẩn. Dị nhiễm sắc bảo thủ đề cập đến các vùng của DNA trong nhiễm sắc thể được tìm thấy trong suốt chu kỳ tế bào. Chúng chủ yếu được tìm thấy gần các vùng quanh tâm động và vùng telomer của nhiễm sắc thể. Trong khi đó, dị nhiễm sắc thông thường chỉ là các vùng chứa DNA, trong đó các gen đa phần bị bất hoạt. Chúng chỉ được kích hoạt trở lại trong một số điều kiện nhất định của tế bào. Sự khác biệt chính của vùng dị nhiễm sắc bảo thủ so với vùng dị nhiễm sắc thông thường là dị nhiễm sắc bảo thủ tồn tại trong suốt chu kỳ tế bào và không mã hóa cho protein, trong khi dị nhiễm sắc thông thường bao gồm các vùng gen im lặng hoặc chưa được kích hoạt của nhiễm sắc thể. 

Các nhiễm sắc thể sau khi nhuộm tạo ra các hình dạng băng đặc trưng. Chính vì đặc trưng này mà người ta có thể phân biệt chúng dựa vào hình ảnh sau nhuộm. Nhờ đó có thể ứng dụng trong nghiên cứu bản đồ nhiễm sắc thể cũng như các bất thường trong nhiễm sắc thể như mất đoạn, chèn hoặc chuyển đoạn (hình 2) 

5.1 Nguyên lý trong phương pháp nhuộm băng nhiễm sắc thể 

Để hiểu quá trình bắt màu của các băng xảy ra như thế nào và mối liên hệ của các băng với cấu trúc nhiễm sắc thể, ta cần hiểu cách các thuốc nhuộm liên kết với nhiễm sắc thể. 

Hầu hết các thuốc nhuộm liên kết với các nhiễm sắc thể thông qua việc gắn với DNA chứ không thông qua protein. Thuốc nhuộm có thể liên kết với DNA thông qua liên kết xen kẽ, liên kết rãnh nhỏ/rãnh chính, hoặc liên kết bên ngoài (hình 3). Các phương thức liên kết này phụ thuộc vào loại tương tác mà thuốc nhuộm gắn vào DNA, có thể là liên kết cộng hóa trị hoặc không cộng hóa trị.  

Sự kết hợp của kim loại có trong thuốc nhuộm với nguyên tử nitơ thường xảy ra ở vị trí số 7 của adenin hoặc guanin. Một số thuốc nhuộm chứa platin thể hiện kiểu tương tác này vì platin có ái lực cao với nitơ. Loại tương tác này dẫn đến liên kết rãnh chính. 

Tương tác không cộng hóa trị bao gồm liên kết hydro, tương tác tĩnh điện. Nguyên tử tích điện âm trong thuốc nhuộm có thể tạo liên kết hydro với DNA tại các vị trí H của các cặp base nitơ. Các vị trí này bao gồm vị trí 6 của adenin, vị trí 4 của cytosine và vị trí 2 của guanin, các liên kết này có thể ở rãnh chính và rãnh phụ của DNA. 

Tương tác tĩnh điện liên quan đến các thuốc nhuộm có nhóm cation. Các nhóm cation tạo thành một tương tác ion với các nhóm photphat tích điện âm của phân tử DNA. Loại tương tác này tạo ra các liên kết vùng ngoài. Các thuốc nhuộm có khả năng tương tác với các phân tử có chứa vòng thơm phẳng thì sẽ bám vào vùng xen kẽ, chèn giữa các cặp base của DNA. 

5.2 Nhuộm Giemsa 

Giemsa là một chất nhuộm có thể nhìn bằng mắt, chất nhuộm được chèn giữa các cặp base của DNA và do đó được sử dụng để nhuộm nhiễm sắc thể. Nó là hỗn hợp của thuốc nhuộm thiazine cation (tích điện dương), quan trọng nhất là azure B, và thuốc nhuộm eosin anion (tích điện âm) như eosin Y. Nhuộm nhiễm sắc thể liên quan đến sự hình thành kết tủa thiazine-eosin theo tỷ lệ mol 2: 1. Thiazin khuếch tán nhanh, xen kẽ giữa các cặp base của DNA đầu tiên cho màu xanh, tiếp theo phân tử eosin lớn, khuếch tán chậm tạo thành kết tủa với các phân tử thiazin do đó làm cho nhiễm sắc thể có màu tím. 

Băng G hoặc Q là vùng giàu A-T còn băng R là vùng giàu G-C của phân tử DNA. Trong khi đó, băng C là vùng giàu A-T của tẩm động, bao gồm vùng dị nhiễm sắc bảo thủ. Băng được tạo ra phụ thuộc vào mức độ biển tính trên cấu trúc của nhiễm sắc thể. Băng G là các dải tối, tương ứng với các vùng kỵ nước của nhiễm sắc thể, hỗ trợ cho sự hình thành liên kết và kết tủa thiazine-eosin. Những vùng này được xác định là dị nhiễm sắc sao chép muộn (heterochromatin). Để nhuộm băng G, các nhiễm sắc thể phải được xử lý trước khi nhuộm bằng giemsa (thường được xử lý bằng một Protease như trypsin). Các băng khác như R và C cũng có thể thu được bằng cách nhuộm giemsa. 

Ngoài ra, dựa vào tính chất liên kết của thuốc nhuộm với các vùng trên phân tử DNA, ta có thể dùng một số thuốc nhuộm khác trong nhuộm nhiễm sắc thể như: 

Thuốc nhuộm huỳnh quang (Fluorochromes) là các phân tử hữu cơ có khả năng phát huỳnh quang. Các phân tử này chứa các hệ thống liên hợp lớn như các nhóm chức vòng thơm hoặc dị vòng và được đặc trưng bởi cấu trúc cứng và phẳng. Chất nhuộm này kém bền vững hơn giemsa. Có thể kể đến DAPI: (4 ’, 6-diamidino- 2-phenylindole) là một fluorochrome được sử dụng rộng rãi trong nhuộm nhiễm sắc thể. 

Thuốc nhuộm huỳnh quang tại chỗ FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) - đây là kỹ thuật lai một mẫu dò (có bản chất là DNA) có gắn một phân tử huỳnh quang và có khả năng bắt cặp bổ sung với trình tự DNA trên gen mục tiêu. Phương pháp này dùng trong việc xác định các đột biến về số lượng, thêm hay mất đoạn của nhiễm sắc thể. 

Nhuộm protein

Trong phân tích protein, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel hoặc trên bản mỏng. Sau quá trình điện di, protein cần được hiển thị dưới dạng hình ảnh, dạng băng hoặc dạng các điểm. Để có được điều này, phương pháp nhuộm màu cho protein là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm cũng như ứng dụng trong y học. 

Một kỹ thuật nhuộm protein cần đáp ứng những yếu tố sau đây: 

Độ nhạy cao và có khả năng tái sử dụng. 

• Có phổ nhuộm rộng. 
• Khả năng tương thích với các công nghệ ứng dụng như chiết xuất,xét nghiệm protein hoặc khối phổ. 
• Nhanh chóng và thuận tiện khi sử dụng. 

Một kỹ thuật nhuộm protein thường bao gồm ba bước chính sau: 

• Cố định protein: bước này nhằm cố định protein trên màng, gel hay các giá thể khác nhau, thường sử dụng methanol hoặc Ethanol có tính acid cho bước này. 
• Nhuộm: cho protein tiếp xúc với dung dịch thuốc nhuộm, có thể phủ, nhúng hoặc ngâm. 
• Rửa: bước này nhằm loại bỏ thuốc nhuộm thừa và các thành phần không mong muốn ra khỏi mẫu protein. 

Trong mỗi phương pháp cụ thể sẽ có những cách thức cải tiến nhằm tối ưu cho mỗi mục đích, nhưng ba bước kể trên là các bước chính, và trọng tâm cho hầu hết các phương pháp nhuộm protein. 

Tuỳ vào mục tiêu ứng dụng, có thể chia phương pháp nhuộm protein thành hai loại là: nhuộm protein tổng số và nhuộm protein đặc hiệu. 

5.3 Nhuộm protein tổng số 

Nhuộm protein tổng số cho phép hình dung được dạng protein trong gel. Dưới đây sẽ so sánh những ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật nhuộm protein tổng số với một số loại thuốc nhuộm phổ biến: 

5.3.1 Nhuộm Coomassie 

Là thuốc nhuộm protein dạng anion phổ biến nhất, Coomassie nhuộm được hầu hết các protein, thuốc nhuộm này có độ nhạy trung bình. Có hai biến thể của Coomassie Brilliant Blue: R-250 (R cho màu đỏ), thời gian nhuộm ngắn và G-250 (G cho màu xanh lục), có độ nhạy hơn và thân thiện với môi trường. Ngoài ra thuốc nhuộm Coomassie cũng là loại thuốc nhuộm thường dùng để đo khối phổ và định lượng protein. 

Coomassie là hợp chất không nguy hiểm với sức khoẻ và môi trường với quy trình nhuộm đơn giản và nhanh chóng.  

5.3.2 Nhuộm bạc 

Thuốc nhuộm làm từ bạc mang lại độ nhạy cao nhất, nhưng phổ nhuộm không cao và tốn thời gian, kỹ thuật cũng khá phức tạp và ít sử dụng trong phân tích định lượng protein. Ngoài ra, bạc có tính tương thích với khối phổ thấp nên cũng ít dùng cho mục đích xác định protein so với nhuộm Coomassie hay nhuộm huỳnh quang. Nhuộm bạc có độ nhạy vượt trội so với Coomassie và tương đương với hầu hết các chất nhuộm huỳnh quang. 

5.3.3 Nhuộm huỳnh quang 

Chất nhuộm có gắn huỳnh quang đáp ứng hầu hết các yêu cầu đối với kỹ thuật nhuộm protein. Đây là chất nhuộm lý tưởng với độ nhạy cao, phương thức đơn giản và mạnh mẽ, khả năng tương thích với khối phổ cũng rất cao. Chất huỳnh quang liên kết chọn lọc với protein mà không liên kết với các thành phần của gel. Tuy nhiên, so với kỹ thuật nhuộm Coomassie hoặc nhuộm bạc, thuốc nhuộm huỳnh quang đắt hơn và yêu cầu về trang thiết bị phân tích đắt đỏ như máy ảnh CCD hoặc máy quét huỳnh quang để tạo ảnh. Vì những lý do này, màu huỳnh quang thường được sử dụng trong các ứng dụng proteomics và điện di 2-D protein trên gel; định lượng tương đối các protein có trong một hỗn hợp phức tạp; xác định danh tính của protein bằng cách sử dụng phương pháp phân hủy protein trong gel và khối phổ. 

5.4 Nhuộm protein đặc hiệu 

Nhuộm protein đặc hiệu được sử dụng để xem xét các protein cụ thể hoặc sự biến đổi của protein như: glycosyl hoá (tạo ra glycoprotein) và phosphoryl hoá (tạo ra phosphoprotein). Mục đích chính là phục vụ nghiên cứu. 

Quy trình kinh điển nhất để phát hiện glycoprotein là sử dụng chất nhuộm Periodate Acid-Schiff (PAS). Đây là phương pháp đặc hiệu phát hiện các protein glycosyl hóa có chứa acid sialic và các nhóm carbohydrat dễ oxy hóa khác. Các protein được phân tách bằng điện di trên gel polyacrylamide (PAGE). Protein được xử lý bằng dung dịch periodate sẽ làm oxy hóa các nhóm đường cis-diol trong glycoprotein. Các nhóm aldehyde tạo thành được phát hiện thông qua sự hình thành các liên kết base Schiff với thuốc thử tạo ra các dải màu đỏ tươi. 

Protein bị phosphoryl hóa là một biến đổi có thể phục hồi được. Các protein bị phosphoryl hoá có vai trò trong việc kích hoạt hay ức chế các con đường tín hiệu cụ thể của tế bào. Pro-Q Diamond là hoá chất dùng trong nhuộm phosphoprotein. Đây là phương pháp nhuộm chọn lọc phosphoprotein trong gel polyacrylamide. Chất nhuộm này lý tưởng cho các nghiên cứu xoay quanh quá trình phosphoryl hoá của protein.

6 Nhuộm acid nucleic (DNA, RNA)

Nucleoprotein là sự kết hợp của protein cơ bản và acid nucleic. Hai acid nucleic là acid deoxyribonucleic (DNA), chủ yếu được tìm thấy trong nhân và acid ribonucleic (RNA) nằm trong tế bào chất của tế bào, chủ yếu nằm trong ribosome. Cả hai phân tử DNA và RNA đều bao gồm các nhóm đường và phosphate thay thế với một base nitơ được gắn vào mỗi nhóm đường. Đường trong DNA là deoxyribose và trong RNA là ribose. Việc nhuộm acid nucleic phụ thuộc vào phản ứng của thuốc nhuộm với các nhóm photphat hoặc sản phẩm andehyde từ đường 

Khi nhuộm DNA và RNA trong tế bào có thể sử dụng một số phương pháp sau: Nhuộm DNA bằng kỹ thuật Feulgen (với sự có mặt của đường deoxyribose) hoặc kỹ thuật methyl green-pyronin (trong đó nhóm photphat kết hợp với thuốc nhuộm cơ bản màu xanh lá cây methyl ở pH acid). DNA cũng có thể được nhuộm bằng phương pháp huỳnh quang sử dụng acridine orange, nhưng chất nhuộm này giảm độ đặc hiệu hơn phương pháp đã đề cập ở trên. Kỹ thuật đặc hiệu và tin cậy nhất là lai tại chỗ bằng các đầu dò probe. Methyl green-pyronin được lựa chọn trong kỹ thuật nhuộm RNA còn Xanh methyl sử dụng trong kỹ thuật nhuộm DNA. 

Cả hai thuốc nhuộm đều là tích điện dương, khi được sử dụng kết hợp cả hai thì xanh metyl ưu tiên liên kết với DNA, và pyronin liên kết với RNA. 

Trong kỹ thuật sinh học phân tử, DNA và RNA được tách ra từ tế bào, mô hay được tổng hợp từ các phản ứng chuỗi PCR trong ống nghiệm. Việc đánh giá, phân tích DNA hay RNA trong các phương pháp này cũng sử dụng một số chất nhuộm. DNA hoặc RNA sẽ được phân tách trên các giá thể như gel agarose hay gel acrylamide bằng phương pháp điện di. Khi đó, việc nhuộm DNA, RNA sẽ dễ dàng thực hiện trên các bản gel này. Các chất nhuộm thông dụng cho DNA, RNA là các chất có khả năng liên kết vào cấu trúc của acid nucleic. 

6.1 Ethidium bromide 

Ethidium bromide (EtB) có thể là chất nhuộm phổ biến nhất được sử dụng cho DNA. Các phân tử của thuốc nhuộm bám vào các sợi DNA và phát huỳnh quang dưới ánh sáng bước sóng ngắn UV. Dưới ánh sáng UV các băng DNA có màu hồng tím, rất dễ nhận biết. Ưu điểm của EtB là dễ sử dụng, nhanh chóng, nhưng nhược điểm là chất này có khả năng gây độc cho người tiếp xúc. Do đó cần hết sức cẩn thận khi làm việc với EtB. 

6.2 SYBR Gold 

Thuốc nhuộm SYBR Gold có thể được sử dụng để nhuộm DNA sợi đôi hoặc sợi đơn hoặc nhuộm RNA. SYBR Gold có độ nhạy cao hơn EtB. Thuốc nhuộm thể hiện khả năng tăng cường huỳnh quang UV gấp 1000 lần khi nó được liên kết với acid nucleic. SYBR Gold có độ an toàn cho người sử dụng hơn là EtB. 

6.3 SYBR Safe và SYBR Green 

Các thuốc nhuộm này được cải tiến từ SYBR Gold, là lựa chọn thay thế an toàn hơn cho ethidium bromide. SYBR Green I nhạy hơn khi sử dụng với DNA sợi đôi, trong khi SYBR Green II hỗ trợ tốt hơn khi sử dụng với DNA và RNA sợi đơn. 

7 Một số tiêu chuẩn về thuốc nhuộm và kỹ thuật nhuộm trong xét nghiệm y sinh học

Có rất nhiều yếu tố liên quan đến thuốc nhuộm và kỹ thuật nhuộm có thể ảnh hưởng đến kết quả đọc. Đôi khi, việc sử dụng cùng một quy trình nhuộm giống hệt nhau nhưng kết quả có thể cho màu sắc bị hơi xanh hoặc hơi hồng trong tổng thể màu sắc giữa các lần làm khác nhau. Một yếu tố khác có thể gặp là việc sử dụng những lô thuốc nhuộm mới, với các nồng độ khác nhau của chất bắt màu cũng có thể dẫn tới kết quả khác nhau. Do vậy, việc tiêu chuẩn hoá quy trình là rất cần thiết. 

Tiêu chuẩn hóa (standardization hay standardisation) là quá trình thực hiện và phát triển các tiêu chuẩn kỹ thuật dựa trên sự đồng thuận của các bên khác nhau bao gồm các công ty, người dùng, nhóm lợi ích, tổ chức tiêu chuẩn và chính phủ. Tiêu chuẩn hóa có thể giúp tối đa hóa tính tương thích, tính tương tác, an toàn, tính lặp lại hoặc chất lượng. Vì vậy, một tiêu chuẩn là một tài liệu thiết lập các thông số kỹ thuật xác định đã được thống nhất tiêu chí, phương pháp, quy trình hoặc nguyên tắc cho quy trình. 

Các tổ chức tiêu chuẩn như Tổ chức Quốc tế về Tiêu chuẩn hóa (ISO), Ủy ban Tiêu chuẩn hóa châu  u (CEN), hoặc Viện Tiêu chuẩn Quốc gia Hoa Kỳ (ANSI), các tổ chức này độc lập với các nhà sản xuất sản phẩm và họ là nơi đưa ra công bố tiêu chuẩn. 

Tiêu chuẩn cho thuốc nhuộm và kỹ thuật nhuộm được sử dụng trong Sinh học và Y học với mục tiêu là vi sinh vật, tế bào học, huyết học và mô bệnh học. 

Mục tiêu này được áp dụng khi mẫu nhuộm bằng thuốc nhuộm, fluorochromes, kháng thể hoặc đầu dò acid nucleic. Để đạt được tiêu chuẩn hoá, các mẫu phải được lấy theo cách thức có kiểm soát, quy trình nhuộm cũng được xử lý một cách có kiểm soát. Ví dụ, với các mẫu đúc parafin, quá trình xử lý mẫu bao gồm cố định, khử nước, rửa, nhúng và cắt mặt cắt. Mỗi bước đều phải được tiêu chuẩn hóa, bao gồm trước phân tích, trong phân tích và sau phân tích. 

8 Tài liệu tham khảo 

1. Sundaram RK, Balasubramaniyan N, Sundaram P. Protein stains and applications. Methods Mol Biol. 2012; 869: 451-64. doi: 10.1007/978-1- 61779-821-4_39. PMID: 22585510. 

2. Ana Katrina C. Estandarte, A Review of the Different Staining Techniques for Human Metaphase Chromosomes. University of London February 24, 2012 

3. Agrawal GK and Thelen JJ (2009). A high-resolution two-dimensional Gel- and Pro-Q DPS-based proteomics workflow for phosphoprotein identification and quantitative profiling. Methods Mol Biol 527, 3-19. 

4. Gottlieb M and Chavko M (1987). Silver staining of native and denatured eukaryotic DNA in agarose gels. Anal Biochem 165(1), 33-37. 

5. Hart C et al. (2003). Detection of glycoproteins in polyacrylamide gels and on electroblots using Pro-Q Emerald 488 dye, a fluorescent periodate Schiff-base stain. Electrophoresis 24, 588-598. 

6. Miller I et al. (2006). Protein stains for proteomic applications: which, when, why? Proteomics 6, 5385-5408. 

7. Neuhoff V et al. (1988). Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear backgrounds at nanogram sensitivity using G-250 and R-250. Electrophoresis 9, 255-262. 

8. Rabilloud T et al. (1994). Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cell Mol Biol 40, 57-75. 

9. Simpson RJ (2010). Rapid coomassie blue staining of protein gels. Cold Spring Harb Protoc, pdb prot5413. 

10. Yan JX et al. (2000). A modified silver staining protocol for visualization of proteins compatible with matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray ionization-mass spectrometry. Electrophoresis 21, 3666-3672. 

11. PGS. TS. BS. Đặng Thị Ngọc Dung, TS. Nguyễn Trọng Tuệ (2023). “Kỹ thuật nhuộm”. Kỹ thuật và thiết bị xét nghiệm y học. Nhà xuất bản y học, trang 103-117. Tải bản pdf tại đây.